閆競(jìng)宇 , 郭志謀, 丁俊杰, 沈愛金, 王紀(jì)霞, 金高娃, 梁鑫淼
(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連116023)
萬古霉素(vancomycin,VAN)是由東方鏈酶菌(Streptomyces orientalis)產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素,目前臨床上主要用來治療嚴(yán)重的革蘭氏陽性菌感染,是治療由金葡菌引起的嚴(yán)重感染的首選藥物[1]。由于萬古霉素具有較好的抗菌作用,除作為藥物使用外,其還常被作為飼料添加劑使用,為防止抗生素濫用引起耐藥性問題,各個(gè)國(guó)家都制定了相應(yīng)的食品殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[2]。因此,無論對(duì)萬古霉素類藥物的質(zhì)量控制[3,4]、藥代動(dòng)力學(xué)研究[5,6],還是對(duì)食品、飼料中萬古霉素類抗生素的非法添加的檢測(cè)[7],都需要發(fā)展合適的色譜分析方法。
萬古霉素分子由兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元組成(見圖1),即親水的糖基部分(氨基糖、葡萄糖)和疏水的肽基部分(7 個(gè)氨基酸交聯(lián)而成的三環(huán)剛性骨架),同時(shí),分子既含有堿性的伯氨基團(tuán),又含有酸性的羧基。萬古霉素的結(jié)構(gòu)特征對(duì)色譜分離效率和峰形帶來了較大的挑戰(zhàn)。此外,萬古霉素由發(fā)酵產(chǎn)生,發(fā)酵過程會(huì)產(chǎn)生較多的結(jié)構(gòu)類似物,萬古霉素本身也可產(chǎn)生降解雜質(zhì),其降解雜質(zhì)如CDP-1 可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)[8],對(duì)這些雜質(zhì)的分離需要較高的分離選擇性。當(dāng)前,對(duì)萬古霉素色譜分析主要采用反相色譜法,以C18 柱為色譜固定相,采用磷酸三乙胺-乙腈-四氫呋喃為流動(dòng)相體系可獲得較好的萬古霉素峰形和對(duì)部分雜質(zhì)的分離選擇性??紤]到上述方法的質(zhì)譜兼容性和分離選擇性問題,Hoogmartens 等[9,10]對(duì)萬古霉素分析方法進(jìn)行了改進(jìn),通過優(yōu)化不同種類的緩沖鹽、有機(jī)溶劑及改變?nèi)軇w系的pH 值來改善分離選擇性,分別采用二氧六環(huán)-甲酸銨流動(dòng)相體系和甲醇-乙酸銨體系實(shí)現(xiàn)對(duì)萬古霉素及主要雜質(zhì)的分離和質(zhì)譜鑒定,改進(jìn)后的體系可與質(zhì)譜兼容,但仍存在分離選擇性不足的問題。Adams 等[11]針對(duì)萬古霉素雜質(zhì)分離問題,篩選了69 種不同廠家的C18 色譜柱,通過色譜柱參數(shù)比對(duì),給出了分離萬古霉素樣品時(shí)色譜柱選擇的參考因素。由此可見,由于萬古霉素分子結(jié)構(gòu)較為特殊,結(jié)構(gòu)類似物多,優(yōu)化后的反相方法仍不能夠提供足夠的分離選擇性,推測(cè)其原因是反相固定相不能提供足夠的極性選擇性。
近年來得到巨大發(fā)展的親水作用色譜方法[12-16]為極性化合物的分離提供了新的途徑,其具有極性選擇性好,質(zhì)譜兼容性高的特點(diǎn)。萬古霉素類化合物本身帶有較強(qiáng)的極性基團(tuán),在親水作用色譜上應(yīng)該可以實(shí)現(xiàn)較好的保留,但目前對(duì)萬古霉素類化合物親水作用色譜保留行為的研究尚未見報(bào)道。本文以萬古霉素及主要雜質(zhì)為研究對(duì)象,通過篩選親水固定相、考察不同流動(dòng)相條件對(duì)保留性質(zhì)的影響,開展該類物質(zhì)親水保留特性研究,為萬古霉素及其結(jié)構(gòu)類似物的親水分離方法的發(fā)展提供了依據(jù)和指導(dǎo)。
Waters Alliance 高效液相色譜儀(Waters,Milford,MA,USA),包括2695 分離單元、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱恒溫系統(tǒng)和2489 紫外檢測(cè)器。乙腈為Merck 公司(Darmstadt,Germany)產(chǎn)品,實(shí)驗(yàn)室用水來自Milli Q 純水凈化系統(tǒng)(Billerica,MA,USA),甲酸、甲酸銨為Acros 公司(Fair Law,NJ,USA)產(chǎn)品。萬古霉素(vancomycin B)、desvancosaminyl vancomycin(DESV)、雙去氯萬古霉素(dedichloro vancomycin,DDCV)、crystalline degradation product (CDP-1)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Toronto Research Chemicals Inc. (Brisbane,Toronto,Canada),去甲萬古霉素(norvancomycin,NORV)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(北京)。
TSK gel Amide-80 柱購(gòu)自日本Tosoh 公司。Atlantis HILIC 柱購(gòu)自Waters 公司(Milford,MA,USA)。ZIC-HILIC 購(gòu)自Merck 公司(Darmstadt,Germany)。Click Maltose 柱為實(shí)驗(yàn)室自制。Venusil HILIC 為北京艾杰爾公司產(chǎn)品。Click XIon為北京華譜新創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)品。以上色譜柱規(guī)格均為150 mm×4.6 mm,5 μm。
1.2.1 色譜柱的篩選
色譜柱溫度設(shè)定為30 ℃,流動(dòng)相流速為1.0 mL/min;流動(dòng)相A 為乙 腈,B 為 水,C 為100 mmol/L 甲酸銨(pH 3.2);梯度洗脫程序:保持10% C 不變,0 ~30 min 由10% B 升至40% B;檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為254 nm。
1.2.2 流動(dòng)相中乙腈含量的影響
使用三元流動(dòng)相體系,保持C 相緩沖鹽恒定為10%,通過調(diào)節(jié)A 和B 的比例改變乙腈含量。
1.2.3 流動(dòng)相中pH 的影響
配制100 mmol/L 甲酸銨,通過調(diào)節(jié)甲酸加入量使pH 分別為3.2、4.2、5.0,使用三元流動(dòng)相體系,等度洗脫,保持65% A 和25% B 不變,更換C 相溶液。
1.2.4 流動(dòng)相中鹽濃度的影響
使用三元流動(dòng)相體系,保持65% A 不變,通過調(diào)節(jié)B 和C 的比例改變緩沖鹽濃度。
1.2.5 萬古霉素及其雜質(zhì)的親水分離
使用三元流動(dòng)相體系,梯度洗脫程序:保持10% C 不變,0 ~40 min 由18% B 升至23% B,40 ~50 min 由23% B 升至25% B。
萬古霉素為發(fā)酵生產(chǎn)得到,同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量的結(jié)構(gòu)類似物,本文選取了萬古霉素產(chǎn)品中較為常見的幾個(gè)雜質(zhì),結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。NORV 相較于萬古霉素丟失一個(gè)甲基結(jié)構(gòu),DESV 為萬古霉素失去一個(gè)氨基糖單元,DDCV 是萬古霉素失去兩個(gè)氯原子。CDP-1 是萬古霉素降解重排之后產(chǎn)生的雜質(zhì),其含有兩個(gè)同分異構(gòu)體,分別為CDP-1-M 和CDP-1-m,該雜質(zhì)會(huì)引發(fā)毒副作用,在萬古霉素質(zhì)量分析中需要嚴(yán)格控制。所選的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品極性都與萬古霉素相近,以此考察親水作用色譜法對(duì)結(jié)構(gòu)類似物的選擇性。
本文篩選了6 種常見的親水作用色譜柱,包括TSKgel Amide-80、Atlantis HILIC、ZIC-HILIC、Click Maltose、Venusil HILIC、Click XIon 色譜柱,這些固定相包含了硅醇基、兩性離子、酰胺、麥芽糖等不同鍵合相,能夠提供不同的分離選擇性。通過考察相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的分離,獲得保留特性,進(jìn)而選擇分離選擇性好,親水性強(qiáng)的色譜固定相。表1 列舉了不同色譜柱對(duì)萬古霉素及主要雜質(zhì)的色譜保留時(shí)間。從萬古霉素及其雜質(zhì)的保留看,所選擇的6 種色譜柱選擇性類似,出峰順序遵從極性從小到大的順序。DESV 比萬古霉素少一個(gè)糖基,故極性減小,先出峰,而CDP-1 重排后,相較于萬古霉素多生成一個(gè)羧基,故極性增大,去甲萬古霉素和去氯萬古霉素均因?yàn)槿サ舴菢O性基團(tuán)(如甲基、氯原子)而使整個(gè)分子極性增強(qiáng)。不同色譜柱的親水性有所差別,從保留時(shí)間看,Atlantis HILIC 保留最弱,Click XIon 柱保留最強(qiáng)。CDP-1 為一對(duì)同分異構(gòu)體,只有ZIC-HILIC 色譜柱在此條件下能將兩個(gè)異構(gòu)體完全分離,但其對(duì)萬古霉素、去甲萬古霉素和CDP-1 的分離度明顯不夠。為使萬古霉素和雜質(zhì)能夠有更充分的調(diào)節(jié)空間和最大的分離度,最后選擇保留最強(qiáng)的Click XIon 柱進(jìn)行流動(dòng)相條件的考察和優(yōu)化。
表1 萬古霉素及其雜質(zhì)在不同色譜柱上的保留時(shí)間Table 1 Retention times of vancomycin and its related impurities on different columns min
2.3.1 流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)溶質(zhì)保留值的影響
在親水作用色譜模式下,乙腈/水比例對(duì)溶質(zhì)的保留影響最大。研究保留值和乙腈含量的關(guān)系,對(duì)于理解萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 柱上的色譜保留機(jī)理具有一定的指導(dǎo)意義。如圖2 所示,萬古霉素及其雜質(zhì)的保留均隨乙腈含量的增加而增加,表現(xiàn)出典型的HILIC 模式特征。同時(shí),從圖中各曲線的變化率看,該類物質(zhì)的保留隨乙腈含量變化幅度均較大,即表現(xiàn)出對(duì)乙腈含量的變化較為敏感,這可能與該類物質(zhì)的分子較大有關(guān)。
圖2 萬古霉素及其雜質(zhì)的保留因子隨乙腈含量的變化圖Fig.2 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus acetonitrile content in the mobile phase
為進(jìn)一步了解其保留機(jī)理,依據(jù)吸附機(jī)理保留值方程(1)[17,18],考察了ln k(k 為化合物的保留因子)和ln CB(CB為水的體積分?jǐn)?shù))的關(guān)系。具體的回歸系數(shù)見表2。從線性回歸系數(shù)(R2)上看,除保留最弱的DESV 的線性系數(shù)低于0.999 0,其余4 個(gè)物質(zhì)都能很好地用該方程進(jìn)行擬合,就此推測(cè)萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 色譜柱上的保留除分配作用以外,還存在與固定相之間的直接的相互作用,例如靜電作用、氫鍵作用、偶極作用等。
表2 萬古霉素及其雜質(zhì)基于方程(1)得到的回歸結(jié)果Table 2 Results of regression equations of vancomycin and impurities based on equation (1)
2.3.2 流動(dòng)相pH 對(duì)溶質(zhì)保留值的影響
流動(dòng)相pH 值對(duì)溶質(zhì)的保留具有重要影響,萬古霉素及其雜質(zhì)帶有多個(gè)極性官能團(tuán),流動(dòng)相pH的改變會(huì)影響不同極性官能團(tuán)的電離狀態(tài),進(jìn)而改變其保留行為。在不同pH 的流動(dòng)相條件下,兩性離子固定相Click XIon 柱所帶電性也會(huì)有所變化[19]。采用65% 乙腈,保持10 mmol/L 緩沖鹽濃度,調(diào)節(jié)甲酸銨-甲酸緩沖鹽體系的pH,分別考察了pH 3.2、4.2、5.0 條件下的分離效果。如圖3 所示,除DESV 外,萬古霉素及其雜質(zhì)的保留均隨流動(dòng)相pH 的增加而增強(qiáng)。推測(cè)這是由于當(dāng)pH 增大時(shí),固定相由正電性轉(zhuǎn)為負(fù)電性,與萬古霉素及其雜質(zhì)的靜電作用增強(qiáng),故保留增強(qiáng)。DESV 相較于其他化合物沒有產(chǎn)生靜電作用的氨基糖結(jié)構(gòu),故保留未受pH 影響。這也進(jìn)一步證實(shí)了萬古霉素及其雜質(zhì)在親水作用色譜中是多種作用力下的保留機(jī)理。
圖3 萬古霉素及其雜質(zhì)的保留因子隨流動(dòng)相pH 的變化圖Fig.3 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus pH of the mobile phase
2.3.3 流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)溶質(zhì)保留值的影響
在親水作用色譜中,緩沖鹽的濃度會(huì)影響溶質(zhì)的保留時(shí)間,也可能改變固定相對(duì)溶質(zhì)的分離選擇性。為了解緩沖鹽濃度對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)保留和選擇性的影響,考察了不同鹽濃度下各物質(zhì)的保留時(shí)間。由乙腈含量實(shí)驗(yàn)可知,萬古霉素及其雜質(zhì)在乙腈含量為65% 時(shí),保留時(shí)間適宜,且各雜質(zhì)之間可得到較好的分離,故本研究采用65% 乙腈。由于萬古霉素及其雜質(zhì)的保留隨pH 增加而增強(qiáng),為了更好地反映鹽濃度的影響,在靜電作用力最弱的pH 3.2 條件下開展實(shí)驗(yàn),通過改變水相和鹽相(100 mmol/L 甲酸銨,pH 3.2)比例,調(diào)節(jié)不同鹽濃度。如圖4 所示,除CDP-1 外,萬古霉素及其雜質(zhì)的保留隨緩沖鹽濃度變化不明顯,這與大多數(shù)小分子樣品在親水作用色譜保留中所展現(xiàn)的保留值隨鹽濃度增大而增加的現(xiàn)象[20]不一致,推測(cè)原因?yàn)槿f古霉素及其雜質(zhì)與固定相的靜電吸引作用隨鹽濃度增加而降低,剛好與由鹽濃度增加導(dǎo)致的保留增強(qiáng)的作用相反,二者共同作用的結(jié)果為保留幾乎沒有發(fā)生明顯變化。而隨鹽濃度的增加,雜質(zhì)CDP-1 的保留有所下降,推測(cè)其原因?yàn)镃DP-1 相較于萬古霉素分子,重排后生成了一個(gè)羧基,致使CDP-1 與固定相的靜電吸引作用增加,當(dāng)鹽濃度增加時(shí),削弱了其與固定相的離子交換作用,故保留有所降低。在對(duì)比不同鹽濃度下萬古霉素及其雜質(zhì)的分離度和保留后,10 mmol/L 鹽被認(rèn)為是較適宜的鹽濃度。
圖4 萬古霉素及其雜質(zhì)保留因子隨緩沖鹽濃度的變化圖Fig.4 Plots of retention factors versus salt concentration in the mobile phase
通過以上對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)的親水保留性質(zhì)的研究可知,萬古霉素及其雜質(zhì)在兩性離子色譜柱上的保留較好,其保留隨乙腈含量、pH 值變化較大,隨鹽濃度變化不大。根據(jù)萬古霉素及其雜質(zhì)的保留性質(zhì),優(yōu)化分離方法,使萬古霉素及其雜質(zhì)能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。圖5 為采用添加甲酸銨的流動(dòng)相梯度條件下對(duì)萬古霉素及主要雜質(zhì)的分離。從圖5 可以看出,雖然萬古霉素和幾個(gè)主要雜質(zhì)的分子差別較小,保留性質(zhì)較為相近,但在當(dāng)前優(yōu)化的條件下仍可實(shí)現(xiàn)較好的分離。CDP-1 為兩個(gè)同分異構(gòu)體,在該條件下,兩個(gè)峰有一定的分離趨勢(shì),保留時(shí)間越長(zhǎng),二者的分離度越大;考慮到分析時(shí)間不宜過長(zhǎng),未繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間改善其分離度。由于購(gòu)買的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品純度不高,仍可見其他雜質(zhì)峰存在,均與萬古霉素實(shí)現(xiàn)較好的分離,體現(xiàn)了親水作用色譜在萬古霉素與雜質(zhì)的分離中具有一定的優(yōu)勢(shì)。同時(shí),該方法采用了質(zhì)譜兼容的乙腈-甲酸銨體系,可以直接用于對(duì)未知雜質(zhì)的鑒定。但是,從峰形上看,萬古霉素、去甲萬古霉素和去氯萬古霉素峰均存在一定程度的前伸,對(duì)分離效率和分離度造成不利影響。因此,HILIC 固定相和方法仍需要進(jìn)一步篩選和優(yōu)化,以改善峰形和提高分離度。
圖5 萬古霉素及其雜質(zhì)的HILIC 譜圖Fig.5 HILIC chromatogram of vancomycin and its related impurities
本文以萬古霉素及其4 個(gè)常見雜質(zhì)為研究對(duì)象,探索了萬古霉素類抗生素的親水作用色譜保留行為。通過對(duì)比萬古霉素及其雜質(zhì)在不同親水鍵合色譜柱上的保留時(shí)間,選取了兩性離子Click XIon色譜柱為固定相。通過考察流動(dòng)相中有機(jī)相比例、鹽濃度及pH 值對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)保留的影響,初步探討了該類物質(zhì)的親水保留機(jī)制及影響因素,并優(yōu)化得到乙腈-甲酸銨(pH 3.2)的流動(dòng)相體系,實(shí)現(xiàn)了萬古霉素及其雜質(zhì)的有效分離。親水作用色譜方法分離萬古霉素及其雜質(zhì),可以獲得較好的保留和分離,質(zhì)譜兼容性好,可彌補(bǔ)反相色譜極性選擇性差的缺點(diǎn),為該類化合物分離提供了新的方法和思路。
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