閆競(jìng)宇 ， 郭志謀， 丁俊杰， 沈愛金， 王紀(jì)霞， 金高娃， 梁鑫淼

（中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023）

萬古霉素（vancomycin，VAN）是由東方鏈酶菌（Streptomyces orientalis）產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素，目前臨床上主要用來治療嚴(yán)重的革蘭氏陽性菌感染，是治療由金葡菌引起的嚴(yán)重感染的首選藥物［1］。由于萬古霉素具有較好的抗菌作用，除作為藥物使用外，其還常被作為飼料添加劑使用，為防止抗生素濫用引起耐藥性問題，各個(gè)國(guó)家都制定了相應(yīng)的食品殘留限量標(biāo)準(zhǔn)［2］。因此，無論對(duì)萬古霉素類藥物的質(zhì)量控制［3，4］、藥代動(dòng)力學(xué)研究［5，6］，還是對(duì)食品、飼料中萬古霉素類抗生素的非法添加的檢測(cè)［7］，都需要發(fā)展合適的色譜分析方法。

萬古霉素分子由兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元組成（見圖1），即親水的糖基部分（氨基糖、葡萄糖）和疏水的肽基部分（7 個(gè)氨基酸交聯(lián)而成的三環(huán)剛性骨架），同時(shí)，分子既含有堿性的伯氨基團(tuán)，又含有酸性的羧基。萬古霉素的結(jié)構(gòu)特征對(duì)色譜分離效率和峰形帶來了較大的挑戰(zhàn)。此外，萬古霉素由發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵過程會(huì)產(chǎn)生較多的結(jié)構(gòu)類似物，萬古霉素本身也可產(chǎn)生降解雜質(zhì)，其降解雜質(zhì)如CDP-1 可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)［8］，對(duì)這些雜質(zhì)的分離需要較高的分離選擇性。當(dāng)前，對(duì)萬古霉素色譜分析主要采用反相色譜法，以C18 柱為色譜固定相，采用磷酸三乙胺-乙腈-四氫呋喃為流動(dòng)相體系可獲得較好的萬古霉素峰形和對(duì)部分雜質(zhì)的分離選擇性?？紤]到上述方法的質(zhì)譜兼容性和分離選擇性問題，Hoogmartens 等［9，10］對(duì)萬古霉素分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過優(yōu)化不同種類的緩沖鹽、有機(jī)溶劑及改變?nèi)軇w系的pH 值來改善分離選擇性，分別采用二氧六環(huán)-甲酸銨流動(dòng)相體系和甲醇-乙酸銨體系實(shí)現(xiàn)對(duì)萬古霉素及主要雜質(zhì)的分離和質(zhì)譜鑒定，改進(jìn)后的體系可與質(zhì)譜兼容，但仍存在分離選擇性不足的問題。Adams 等［11］針對(duì)萬古霉素雜質(zhì)分離問題，篩選了69 種不同廠家的C18 色譜柱，通過色譜柱參數(shù)比對(duì)，給出了分離萬古霉素樣品時(shí)色譜柱選擇的參考因素。由此可見，由于萬古霉素分子結(jié)構(gòu)較為特殊，結(jié)構(gòu)類似物多，優(yōu)化后的反相方法仍不能夠提供足夠的分離選擇性，推測(cè)其原因是反相固定相不能提供足夠的極性選擇性。

近年來得到巨大發(fā)展的親水作用色譜方法［12-16］為極性化合物的分離提供了新的途徑，其具有極性選擇性好，質(zhì)譜兼容性高的特點(diǎn)。萬古霉素類化合物本身帶有較強(qiáng)的極性基團(tuán)，在親水作用色譜上應(yīng)該可以實(shí)現(xiàn)較好的保留，但目前對(duì)萬古霉素類化合物親水作用色譜保留行為的研究尚未見報(bào)道。本文以萬古霉素及主要雜質(zhì)為研究對(duì)象，通過篩選親水固定相、考察不同流動(dòng)相條件對(duì)保留性質(zhì)的影響，開展該類物質(zhì)親水保留特性研究，為萬古霉素及其結(jié)構(gòu)類似物的親水分離方法的發(fā)展提供了依據(jù)和指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Alliance 高效液相色譜儀（Waters，Milford，MA，USA），包括2695 分離單元、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱恒溫系統(tǒng)和2489 紫外檢測(cè)器。乙腈為Merck 公司（Darmstadt，Germany）產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)室用水來自Milli Q 純水凈化系統(tǒng)（Billerica，MA，USA），甲酸、甲酸銨為Acros 公司（Fair Law，NJ，USA）產(chǎn)品。萬古霉素（vancomycin B）、desvancosaminyl vancomycin（DESV）、雙去氯萬古霉素（dedichloro vancomycin，DDCV）、crystalline degradation product （CDP-1）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Toronto Research Chemicals Inc. （Brisbane，Toronto，Canada），去甲萬古霉素（norvancomycin，NORV）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（北京）。

TSK gel Amide-80 柱購(gòu)自日本Tosoh 公司。Atlantis HILIC 柱購(gòu)自Waters 公司（Milford，MA，USA）。ZIC-HILIC 購(gòu)自Merck 公司（Darmstadt，Germany）。Click Maltose 柱為實(shí)驗(yàn)室自制。Venusil HILIC 為北京艾杰爾公司產(chǎn)品。Click XIon為北京華譜新創(chuàng)科技有限公司產(chǎn)品。以上色譜柱規(guī)格均為150 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 色譜條件

1.2.1 色譜柱的篩選

色譜柱溫度設(shè)定為30 ℃，流動(dòng)相流速為1.0 mL／min；流動(dòng)相A 為乙 腈，B 為 水，C 為100 mmol／L 甲酸銨（pH 3.2）；梯度洗脫程序：保持10% C 不變，0 ～30 min 由10% B 升至40% B；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為254 nm。

1.2.2 流動(dòng)相中乙腈含量的影響

使用三元流動(dòng)相體系，保持C 相緩沖鹽恒定為10%，通過調(diào)節(jié)A 和B 的比例改變乙腈含量。

1.2.3 流動(dòng)相中pH 的影響

配制100 mmol／L 甲酸銨，通過調(diào)節(jié)甲酸加入量使pH 分別為3.2、4.2、5.0，使用三元流動(dòng)相體系，等度洗脫，保持65% A 和25% B 不變，更換C 相溶液。

1.2.4 流動(dòng)相中鹽濃度的影響

使用三元流動(dòng)相體系，保持65% A 不變，通過調(diào)節(jié)B 和C 的比例改變緩沖鹽濃度。

1.2.5 萬古霉素及其雜質(zhì)的親水分離

使用三元流動(dòng)相體系，梯度洗脫程序：保持10% C 不變，0 ～40 min 由18% B 升至23% B，40 ～50 min 由23% B 升至25% B。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的選擇

萬古霉素為發(fā)酵生產(chǎn)得到，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量的結(jié)構(gòu)類似物，本文選取了萬古霉素產(chǎn)品中較為常見的幾個(gè)雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。NORV 相較于萬古霉素丟失一個(gè)甲基結(jié)構(gòu)，DESV 為萬古霉素失去一個(gè)氨基糖單元，DDCV 是萬古霉素失去兩個(gè)氯原子。CDP-1 是萬古霉素降解重排之后產(chǎn)生的雜質(zhì)，其含有兩個(gè)同分異構(gòu)體，分別為CDP-1-M 和CDP-1-m，該雜質(zhì)會(huì)引發(fā)毒副作用，在萬古霉素質(zhì)量分析中需要嚴(yán)格控制。所選的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品極性都與萬古霉素相近，以此考察親水作用色譜法對(duì)結(jié)構(gòu)類似物的選擇性。

2.2 色譜柱的篩選

本文篩選了6 種常見的親水作用色譜柱，包括TSKgel Amide-80、Atlantis HILIC、ZIC-HILIC、Click Maltose、Venusil HILIC、Click XIon 色譜柱，這些固定相包含了硅醇基、兩性離子、酰胺、麥芽糖等不同鍵合相，能夠提供不同的分離選擇性。通過考察相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的分離，獲得保留特性，進(jìn)而選擇分離選擇性好，親水性強(qiáng)的色譜固定相。表1 列舉了不同色譜柱對(duì)萬古霉素及主要雜質(zhì)的色譜保留時(shí)間。從萬古霉素及其雜質(zhì)的保留看，所選擇的6 種色譜柱選擇性類似，出峰順序遵從極性從小到大的順序。DESV 比萬古霉素少一個(gè)糖基，故極性減小，先出峰，而CDP-1 重排后，相較于萬古霉素多生成一個(gè)羧基，故極性增大，去甲萬古霉素和去氯萬古霉素均因?yàn)槿サ舴菢O性基團(tuán)（如甲基、氯原子）而使整個(gè)分子極性增強(qiáng)。不同色譜柱的親水性有所差別，從保留時(shí)間看，Atlantis HILIC 保留最弱，Click XIon 柱保留最強(qiáng)。CDP-1 為一對(duì)同分異構(gòu)體，只有ZIC-HILIC 色譜柱在此條件下能將兩個(gè)異構(gòu)體完全分離，但其對(duì)萬古霉素、去甲萬古霉素和CDP-1 的分離度明顯不夠。為使萬古霉素和雜質(zhì)能夠有更充分的調(diào)節(jié)空間和最大的分離度，最后選擇保留最強(qiáng)的Click XIon 柱進(jìn)行流動(dòng)相條件的考察和優(yōu)化。

表1 萬古霉素及其雜質(zhì)在不同色譜柱上的保留時(shí)間Table 1 Retention times of vancomycin and its related impurities on different columns min

2.3 萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 柱上的色譜保留行為研究

2.3.1 流動(dòng)相中乙腈含量對(duì)溶質(zhì)保留值的影響

在親水作用色譜模式下，乙腈／水比例對(duì)溶質(zhì)的保留影響最大。研究保留值和乙腈含量的關(guān)系，對(duì)于理解萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 柱上的色譜保留機(jī)理具有一定的指導(dǎo)意義。如圖2 所示，萬古霉素及其雜質(zhì)的保留均隨乙腈含量的增加而增加，表現(xiàn)出典型的HILIC 模式特征。同時(shí)，從圖中各曲線的變化率看，該類物質(zhì)的保留隨乙腈含量變化幅度均較大，即表現(xiàn)出對(duì)乙腈含量的變化較為敏感，這可能與該類物質(zhì)的分子較大有關(guān)。

圖2 萬古霉素及其雜質(zhì)的保留因子隨乙腈含量的變化圖Fig.2 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus acetonitrile content in the mobile phase

為進(jìn)一步了解其保留機(jī)理，依據(jù)吸附機(jī)理保留值方程（1）［17，18］，考察了ln k（k 為化合物的保留因子）和ln CB（CB為水的體積分?jǐn)?shù)）的關(guān)系。具體的回歸系數(shù)見表2。從線性回歸系數(shù)（R2）上看，除保留最弱的DESV 的線性系數(shù)低于0.999 0，其余4 個(gè)物質(zhì)都能很好地用該方程進(jìn)行擬合，就此推測(cè)萬古霉素及其雜質(zhì)在Click XIon 色譜柱上的保留除分配作用以外，還存在與固定相之間的直接的相互作用，例如靜電作用、氫鍵作用、偶極作用等。

表2 萬古霉素及其雜質(zhì)基于方程（1）得到的回歸結(jié)果Table 2 Results of regression equations of vancomycin and impurities based on equation （1）

2.3.2 流動(dòng)相pH 對(duì)溶質(zhì)保留值的影響

流動(dòng)相pH 值對(duì)溶質(zhì)的保留具有重要影響，萬古霉素及其雜質(zhì)帶有多個(gè)極性官能團(tuán)，流動(dòng)相pH的改變會(huì)影響不同極性官能團(tuán)的電離狀態(tài)，進(jìn)而改變其保留行為。在不同pH 的流動(dòng)相條件下，兩性離子固定相Click XIon 柱所帶電性也會(huì)有所變化［19］。采用65% 乙腈，保持10 mmol／L 緩沖鹽濃度，調(diào)節(jié)甲酸銨-甲酸緩沖鹽體系的pH，分別考察了pH 3.2、4.2、5.0 條件下的分離效果。如圖3 所示，除DESV 外，萬古霉素及其雜質(zhì)的保留均隨流動(dòng)相pH 的增加而增強(qiáng)。推測(cè)這是由于當(dāng)pH 增大時(shí)，固定相由正電性轉(zhuǎn)為負(fù)電性，與萬古霉素及其雜質(zhì)的靜電作用增強(qiáng)，故保留增強(qiáng)。DESV 相較于其他化合物沒有產(chǎn)生靜電作用的氨基糖結(jié)構(gòu)，故保留未受pH 影響。這也進(jìn)一步證實(shí)了萬古霉素及其雜質(zhì)在親水作用色譜中是多種作用力下的保留機(jī)理。

圖3 萬古霉素及其雜質(zhì)的保留因子隨流動(dòng)相pH 的變化圖Fig.3 Plots of retention factors of vancomycin and its related impurities versus pH of the mobile phase

2.3.3 流動(dòng)相中鹽濃度對(duì)溶質(zhì)保留值的影響

在親水作用色譜中，緩沖鹽的濃度會(huì)影響溶質(zhì)的保留時(shí)間，也可能改變固定相對(duì)溶質(zhì)的分離選擇性。為了解緩沖鹽濃度對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)保留和選擇性的影響，考察了不同鹽濃度下各物質(zhì)的保留時(shí)間。由乙腈含量實(shí)驗(yàn)可知，萬古霉素及其雜質(zhì)在乙腈含量為65% 時(shí)，保留時(shí)間適宜，且各雜質(zhì)之間可得到較好的分離，故本研究采用65% 乙腈。由于萬古霉素及其雜質(zhì)的保留隨pH 增加而增強(qiáng)，為了更好地反映鹽濃度的影響，在靜電作用力最弱的pH 3.2 條件下開展實(shí)驗(yàn)，通過改變水相和鹽相（100 mmol／L 甲酸銨，pH 3.2）比例，調(diào)節(jié)不同鹽濃度。如圖4 所示，除CDP-1 外，萬古霉素及其雜質(zhì)的保留隨緩沖鹽濃度變化不明顯，這與大多數(shù)小分子樣品在親水作用色譜保留中所展現(xiàn)的保留值隨鹽濃度增大而增加的現(xiàn)象［20］不一致，推測(cè)原因?yàn)槿f古霉素及其雜質(zhì)與固定相的靜電吸引作用隨鹽濃度增加而降低，剛好與由鹽濃度增加導(dǎo)致的保留增強(qiáng)的作用相反，二者共同作用的結(jié)果為保留幾乎沒有發(fā)生明顯變化。而隨鹽濃度的增加，雜質(zhì)CDP-1 的保留有所下降，推測(cè)其原因?yàn)镃DP-1 相較于萬古霉素分子，重排后生成了一個(gè)羧基，致使CDP-1 與固定相的靜電吸引作用增加，當(dāng)鹽濃度增加時(shí)，削弱了其與固定相的離子交換作用，故保留有所降低。在對(duì)比不同鹽濃度下萬古霉素及其雜質(zhì)的分離度和保留后，10 mmol／L 鹽被認(rèn)為是較適宜的鹽濃度。

圖4 萬古霉素及其雜質(zhì)保留因子隨緩沖鹽濃度的變化圖Fig.4 Plots of retention factors versus salt concentration in the mobile phase

2.4 萬古霉素及其雜質(zhì)在親水作用色譜模式下的分離

通過以上對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)的親水保留性質(zhì)的研究可知，萬古霉素及其雜質(zhì)在兩性離子色譜柱上的保留較好，其保留隨乙腈含量、pH 值變化較大，隨鹽濃度變化不大。根據(jù)萬古霉素及其雜質(zhì)的保留性質(zhì)，優(yōu)化分離方法，使萬古霉素及其雜質(zhì)能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。圖5 為采用添加甲酸銨的流動(dòng)相梯度條件下對(duì)萬古霉素及主要雜質(zhì)的分離。從圖5 可以看出，雖然萬古霉素和幾個(gè)主要雜質(zhì)的分子差別較小，保留性質(zhì)較為相近，但在當(dāng)前優(yōu)化的條件下仍可實(shí)現(xiàn)較好的分離。CDP-1 為兩個(gè)同分異構(gòu)體，在該條件下，兩個(gè)峰有一定的分離趨勢(shì)，保留時(shí)間越長(zhǎng)，二者的分離度越大；考慮到分析時(shí)間不宜過長(zhǎng)，未繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間改善其分離度。由于購(gòu)買的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品純度不高，仍可見其他雜質(zhì)峰存在，均與萬古霉素實(shí)現(xiàn)較好的分離，體現(xiàn)了親水作用色譜在萬古霉素與雜質(zhì)的分離中具有一定的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，該方法采用了質(zhì)譜兼容的乙腈-甲酸銨體系，可以直接用于對(duì)未知雜質(zhì)的鑒定。但是，從峰形上看，萬古霉素、去甲萬古霉素和去氯萬古霉素峰均存在一定程度的前伸，對(duì)分離效率和分離度造成不利影響。因此，HILIC 固定相和方法仍需要進(jìn)一步篩選和優(yōu)化，以改善峰形和提高分離度。

圖5 萬古霉素及其雜質(zhì)的HILIC 譜圖Fig.5 HILIC chromatogram of vancomycin and its related impurities

3 結(jié)論

本文以萬古霉素及其4 個(gè)常見雜質(zhì)為研究對(duì)象，探索了萬古霉素類抗生素的親水作用色譜保留行為。通過對(duì)比萬古霉素及其雜質(zhì)在不同親水鍵合色譜柱上的保留時(shí)間，選取了兩性離子Click XIon色譜柱為固定相。通過考察流動(dòng)相中有機(jī)相比例、鹽濃度及pH 值對(duì)萬古霉素及其雜質(zhì)保留的影響，初步探討了該類物質(zhì)的親水保留機(jī)制及影響因素，并優(yōu)化得到乙腈-甲酸銨（pH 3.2）的流動(dòng)相體系，實(shí)現(xiàn)了萬古霉素及其雜質(zhì)的有效分離。親水作用色譜方法分離萬古霉素及其雜質(zhì)，可以獲得較好的保留和分離，質(zhì)譜兼容性好，可彌補(bǔ)反相色譜極性選擇性差的缺點(diǎn)，為該類化合物分離提供了新的方法和思路。

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