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        碳青霉烯類抗生素親水作用色譜方法研究及其應(yīng)用

        2015-12-26 01:58:48朱銀芳紀(jì)順利李紹輝章飛芳梁鑫淼
        色譜 2015年9期
        關(guān)鍵詞:影響

        朱銀芳, 紀(jì)順利, 李紹輝, 李 成, 章飛芳* , 梁鑫淼,2

        (1. 華東理工大學(xué),上海200237;2. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧 大連116023)

        碳青霉烯類抗生素屬于非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素,對大多數(shù)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌具有廣譜抗菌活性[1-3]。該類抗生素通過與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成,從而發(fā)揮抗菌作用。在臨床上,被廣泛用于各種嚴(yán)重細(xì)菌感染的治療,如腹內(nèi)、泌尿道、下呼吸道或皮膚感染等,市場前景良好[1-3]。然而抗生素類藥物的大量使用,不僅會(huì)使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng),還會(huì)對環(huán)境生態(tài)和人類健康產(chǎn)生影響。有必要發(fā)展該類抗生素的快速、靈敏的分析方法。

        目前國內(nèi)外已有很多關(guān)于碳青霉烯類抗生素的分析研究,主要包括生物基質(zhì)和藥物制劑中該類抗生素的含量測定及其質(zhì)量控制[4-7]。文獻(xiàn)報(bào)道的碳青霉烯類抗生素的分析方法包括反相色譜法(RPHPLC)[8-12]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[13-15]、毛細(xì)管電泳法(CE)[16,17]和微生物學(xué)測定法[18]等。其中,RP-HPLC 是碳青霉烯類抗生素最常用的分析方法,但該模式常常需要使用高濃度磷酸鹽或醋酸鈉緩沖液作為流動(dòng)相添加劑,這些不揮發(fā)性無機(jī)鹽與質(zhì)譜不兼容,故所發(fā)展方法無法與質(zhì)譜聯(lián)用。這就難以滿足某些痕量抗生素殘留檢測的需求。

        1990 年Alpert 首次提出的親水作用色譜(HILIC)特別適合用來分離極性或堿性化合物[19]。隨著HILIC 的發(fā)展,它已被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域,如代謝組學(xué)研究[20,21]、藥品及其雜質(zhì)分析[22]和二維液相色譜分析[23,24]等。盡管如此,親水作用色譜法應(yīng)用于碳青霉烯類抗生素分析的文獻(xiàn)報(bào)道非常有限[25,26]。因此,本文系統(tǒng)考察了乙腈比例、緩沖鹽濃度和pH對4 種碳青霉烯類抗生素(比阿培南、美羅培南、多利培南、厄他培南)在XAmide 色譜柱上保留的影響,建立了測定尿液和自來水中4 種碳青霉烯類抗生素的HILIC 分析方法。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        Waters Alliance 高效液相色譜儀(美國Waters公司),包括e2695 分離單元(自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣器和四元泵)、2489 紫外檢測器;Milli-Q 純水凈化系統(tǒng)(美國Millipore 公司);KH5200B 型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);pH 計(jì)(美國Mettler Toledo 公司)。

        比阿培南、多利培南、美羅培南和厄他培南標(biāo)準(zhǔn)品(沈陽東北制藥總廠),于-70 ℃避光保存,其結(jié)構(gòu)如圖1 所示;乙腈(ACN)(HPLC 級,北京百靈威科技有限公司);甲酸銨(HCOONH4)和甲酸(HCOOH)(純度分別為99% 和98%,美國Acros 公司)。實(shí)驗(yàn)中所用試劑至少為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 純水凈化系統(tǒng)制備的超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

        1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        分別準(zhǔn)確稱取4 種碳青霉烯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品適量,用水溶解并配制成1 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分裝在冷凍管中,于-70 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。使用時(shí)待室溫融化后稀釋至所需濃度。準(zhǔn)確移取適量的4種抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用起始流動(dòng)相配制成10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃下避光保存。用起始流動(dòng)相逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 和250 mg/L 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃避光保存。根據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道,該類抗生素由于其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)β-內(nèi)酰胺環(huán),在水溶液中不穩(wěn)定,且對光照和溫度敏感,易發(fā)生降解,故將其低溫避光保存。

        圖1 4 種碳青霉烯類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of the four carbapenems

        1.3 色譜條件

        色譜柱:XAmide 色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm,華譜新創(chuàng)科技有限公司),柱溫:25 ℃;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;檢測波長:293 nm;分離條件:流動(dòng)相A 為水,B 為乙腈,C 為0.1 mol/L 甲酸銨(pH=5.4);梯度洗脫程序:0 ~15 min,90% B ~60% B,10% C;15 ~17 min,60% B ~90% B,10% C。

        1.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)及空白試驗(yàn)

        選用不含有上述4 種抗生素的健康志愿者尿液及自來水樣品,分別添加兩個(gè)含量水平(5 mg/L 和25 mg/L)的各抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),進(jìn)行回收率試驗(yàn),每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)平行樣品。其中尿液樣品在3 500 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min 后,取上清液進(jìn)行HPLC分析。實(shí)驗(yàn)中選取超純水為試樣,進(jìn)行空白試驗(yàn)。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 色譜條件的優(yōu)化

        主要考察了乙腈比例、緩沖鹽濃度和pH 對4種碳青霉烯類抗生素保留的影響。

        2.1.1 乙腈比例的影響

        在HILIC 中,乙腈通常為弱洗脫溶劑,而水則是強(qiáng)洗脫溶劑。因此,流動(dòng)相中乙腈比例是影響目標(biāo)組分保留的重要因素之一。通過保持流動(dòng)相中甲酸銨濃度和pH 不變,考察了流動(dòng)相中乙腈比例對抗生素保留的影響。如圖2 所示,隨著乙腈濃度的增加4 種組分的保留均不斷增加,這與RPLC 模式下正好相反,表明4 種抗生素在XAmide 色譜柱上的保留屬于典型的HILIC 保留機(jī)理。綜合分析時(shí)間、保留強(qiáng)度和對稱因子,選擇乙腈比例為0 ~5 min,80% ~65% ACN;5 ~12 min,65% ACN;12~14 min,65% ~80% ACN 以進(jìn)行后續(xù)研究。

        圖2 乙腈體積分?jǐn)?shù)對保留的影響Fig.2 Effect of ACN volume percentage on the retention

        為深入理解碳青霉烯類抗生素在XAmide 色譜柱上的親水保留行為,特考察如下:根據(jù)色譜分離中描述分配機(jī)理的理論方程(1)[27]和描述吸附機(jī)理的理論方程(2)[28,29]以及盧佩章等提出的液-固色譜保留值方程(3)[30,31],對流動(dòng)相中不同水含量條件下各個(gè)抗生素的保留因子(k)和水含量進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表1。

        方程(1)中,k 為溶質(zhì)保留因子,CB為流動(dòng)相中水相的體積分?jǐn)?shù),kw是弱洗脫溶劑為流動(dòng)相時(shí)的溶質(zhì)保留因子,S 是一個(gè)依賴于溶質(zhì)和實(shí)驗(yàn)條件的常數(shù);方程(2)中,k 為溶質(zhì)保留因子,kB是流動(dòng)相采用強(qiáng)洗脫溶劑時(shí)的溶質(zhì)保留因子,AS和nB的比值為一常數(shù),CB為流動(dòng)相中水相體積分?jǐn)?shù);方程(3)中,k 為溶質(zhì)保留因子,CB為流動(dòng)相中水相的體積分?jǐn)?shù),a、b 和c 是常數(shù)。從表1 中數(shù)據(jù)可見,4 種抗生素采用方程(3)得到的線性相關(guān)系數(shù)更高,這表明吸附機(jī)理在分離中起主導(dǎo)作用。

        2.1.2 鹽濃度的影響

        HILIC 流動(dòng)相中通常加入一些揮發(fā)性緩沖鹽(甲酸銨或乙酸銨)以改善保留和峰形。保持乙腈比例和pH 不變,考察流動(dòng)相中甲酸銨濃度的影響,如圖3 所示。隨著甲酸銨濃度的升高,美羅培南的保留先減弱后增加,多利培南和比阿培南的保留有增強(qiáng)的趨勢,總的來說,上述3 種抗生素的保留基本不變;而厄他培南隨著鹽濃度的升高保留減弱。緩沖鹽濃度的升高對保留主要有兩方面的影響:一是溶質(zhì)和固定相表面酰胺基和殘余的硅醇基之間的離子相互作用會(huì)受到干擾,導(dǎo)致離子交換對保留行為的影響降低,保留減弱;二是使固定相表面的富水層的親水作用(極性)增強(qiáng),因而對溶質(zhì)的保留增強(qiáng)。因此,多利培南和比阿培南主要受第二種作用的影響,美羅培南受兩方面的綜合影響,而厄他培南主要受第一種作用的影響。此外,比阿培南、多利培南和美羅培南的保留隨鹽濃度的升高變化趨勢不明顯,這可能是因?yàn)榧姿徜@對離子交換作用的干擾減弱了甲酸銨對溶質(zhì)保留的影響。甲酸銨的存在可有效改善峰形,特別是美羅培南的峰形(美羅培南拖尾比較嚴(yán)重)。綜合考慮對稱因子和分離度,選擇在流動(dòng)相中加入10% (v/v)的0.1 mol/L 甲酸銨。

        圖3 鹽濃度對保留的影響Fig.3 Effect of salt concentration on the retention

        表1 4 種抗生素在XAmide 色譜柱上基于不同回歸方程的回歸參數(shù)Table 1 Regression parameters of the four carbapenems on XAmide column based on different equations

        2.1.3 緩沖鹽pH 的影響

        圖4 是緩沖鹽pH 值對4 種抗生素在XAmide色譜柱上保留的影響。新配制的甲酸銨(0.1 mol/L)的pH 值約為6.25,使用甲酸調(diào)節(jié)pH 值從3.0 到6.0。可以看出,緩沖鹽pH 對4 種抗生素的保留影響較大。隨著緩沖鹽pH 的升高,4 種抗生素的保留呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢,尤其是厄他培南趨勢最明顯。這可能是由于隨著pH 逐漸升高,填料表面由于酰胺基和殘余硅醇基存在而使凈的負(fù)電荷增多,與目標(biāo)樣品之間的靜電吸引作用加強(qiáng)最終導(dǎo)致分析物的保留增強(qiáng)。但與此同時(shí),pH 升高也會(huì)抑制抗生素的解離。一方面,物質(zhì)的離子狀態(tài)比分子狀態(tài)更有利于保留;另一方面,抑制抗生素的解離也會(huì)減弱與固定相之間的靜電作用。而低pH 條件下,這種作用對抗生素解離的影響不大,在圖中表現(xiàn)為保留增強(qiáng);較高pH 條件下,對抗生素的解離影響較大,在圖中呈現(xiàn)出保留減弱的趨勢。綜合考慮選擇pH 5.4 的緩沖鹽溶液。

        圖4 緩沖液pH 對保留的影響Fig.4 Effect of buffer pH on the retention

        2.2 方法的線性范圍、定量限和精密度

        在優(yōu)化條件下的典型色譜圖如圖5 所示。4 種抗生素的出峰順序與其極性順序相匹配,進(jìn)一步印證了HILIC 的保留機(jī)理。在優(yōu)化條件下考察了4 種抗生素的線性范圍和定量限,具體數(shù)據(jù)見表2。可以看出,4 種抗生素的峰面積y 與其質(zhì)量濃度x(mg/L)存在良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.999 以上。4 種抗生素的定量限范圍為0.1~0.5 mg/L。同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次,測得日內(nèi)精密度(RSD)小于3.5%。

        圖5 4 種碳青霉烯類抗生素的典型色譜圖Fig.5 Typical chromatogram of the four carbapenems

        表2 4 種抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限(n=3)Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and limits of quantitation (LOQs)of the four carbapenems (n=3)

        2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

        為驗(yàn)證所發(fā)展方法的實(shí)用性,進(jìn)行了尿液和自來水中4 種抗生素的加標(biāo)回收率試驗(yàn)。對于尿液樣品,在5 mg/L 和25 mg/L 兩個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),所得回收率為100.4% ~111.9%,RSD<1%。對于自來水樣品,在5 mg/L 和25 mg/L 兩個(gè)加標(biāo)水平所得回收率為79.6% ~107.4%,RSD <5%。

        3 結(jié)論

        本文建立了同時(shí)測定人尿液和自來水中4 種碳青霉烯類抗生素的HILIC 分析方法。通過優(yōu)化分離條件,4 種抗生素均得到了基線分離,且可在15 min 內(nèi)完成分離;結(jié)果表明4 種抗生素在XAmide色譜柱上的保留以吸附為主,符合典型HILIC 機(jī)理。本方法所使用的流動(dòng)相與質(zhì)譜兼容,因此可拓展用于HILIC-MS 聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)對痕量抗生素的測定。這方面的工作尚在進(jìn)行中。

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