姜 舸， 沈愛金， 郭志謀， 李秀玲 ， 梁鑫淼

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116023）

親水作用色譜（HILIC）的概念是由Alpert［1］于1990 年提出的。HILIC 采用親水的極性材料為固定相，水-有機相為流動相。HILIC 與正相色譜類似，對強極性的化合物有很強的保留。HILIC 的固定相上鍵合不同的基團，能表現(xiàn)出不同的保留機制，通過改變流動相中水-有機相的比例，就可以分離不同極性的化合物［2］。反相色譜常用C18 為固定相，糖類等強極性化合物在反相色譜固定相上很難保留，HILIC 是反相色譜的有效補充，與反相色譜有很好的正交性［3］。

糖類化合物的色譜分析對于深入研究其結(jié)構(gòu)表征和生物活性具有重要意義［4］。糖類化合物是含有多羥基的強極性化合物，在反相色譜上基本不保留，在正相色譜非極性流動相中溶解度低，HILIC 可以解決這些問題［4-8］。Click TE-Cys 是我們課題組合成的一種兩性離子材料，其結(jié)構(gòu)特點是硅膠表面鍵合了半胱氨酸。不同于傳統(tǒng)的HILIC 材料，兩性離子材料同時存在正電荷中心和負(fù)電荷中心，具有很好的親水性［9］，Click TE-Cys 材料上電荷相反的離子平行鍵合在硅膠表面，因此親水性強，分離極性化合物的能力強［10，11］。Click TE-Cys 材料用于糖類分析的保留機理的研究尚無報道。本文考察了糖類化合物在Click TE-Cys 色譜柱上液相色譜參數(shù)對其保留的影響，并采用保留方程ln k ＝a＋bln CB＋cCB對其保留行為和保留規(guī)律進行了定量描述。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜系統(tǒng)包括2695 梯度泵、自動進樣器、柱恒溫系統(tǒng)、2424 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）和Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）。色譜柱：Click TE-Cys 色譜柱（150 mm×4.6 mm，材料顆粒直徑為5 μm，自制）。

9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司。其中木糖（xylose）、甘露糖（mannose）、半乳糖（galactose）和唾液酸（sialic acid）是單糖，蔗糖（sucrose）、麥芽糖（maltose）、乳糖（lactose）是二糖，松三糖（melizitose）和棉籽糖（raffinose）是三糖。乙腈（HPLC 級，德國Merck 公司），甲酸銨（純度99%，J＆K 中國公司），Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore 公司）。

9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別用50% （體積分?jǐn)?shù)）的甲醇／水溶液溶解，配制成1 g／L 的溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

稱取12.6 g 甲酸銨固體溶入1 L 水中，用甲酸將其pH 值調(diào)至3.35，配制成0.2 mol／L 的甲酸銨緩沖溶液。

1.2 實驗條件

高效液相色譜流動相：A 相為乙腈，B 相為水，C相為甲酸銨緩沖溶液。流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃；檢測器：ELSD；吹掃氮氣壓力：2.069×105Pa，漂移管溫度：75 ℃，增益值：80。

考察流動相中有機相比例對化合物保留行為的影響時，A 相的體積比依次為85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50% 和40%，C 相的體積比為2.5%?？疾炀彌_鹽對化合物保留行為的影響時，A 相的體積比為73%，C 相的體積比依次為0、2.5%、5%、10%、15% 和20%，C 相體積比為0 時，流動相pH 值調(diào)至3.35。每組試驗重復(fù)兩次。

保留因子k ＝（tR-t0）／t0，其中，tR為溶質(zhì)保留時間，t0為死時間。進樣0.5 μL 甲苯，用100% 乙腈作流動相得到甲苯的保留時間即為t0。試驗測得Click TE-Cys 色譜柱的死時間t0為2.600 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 水相比例變化對糖類化合物在Click TE-Cys色譜柱上保留行為的影響

本文選擇了9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品作為研究對象，考察了流動相參數(shù)變化對其保留行為的影響。9種糖類化合物的結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

HILIC 保留行為受到多種參數(shù)的影響。除了固定相的化學(xué)性質(zhì)，HILIC 中流動相的組成對極性化合物的保留和選擇性也有很大影響［12-14］。本文主要考察了流動相中水相比例和鹽濃度對糖類化合物保留行為的影響。

傅青等［2］考察了流動相中甲醇、丙酮和乙腈對糖類化合物在親水作用色譜下保留行為的影響；韓超等［15］考察了流動相中甲醇、乙醇、四氫呋喃和乙腈在親水作用色譜下對強極性化合物保留的影響。結(jié)果均表明乙腈更適合作為HILIC 流動相中的有機相。因此，本文選用乙腈-水體系作為HILIC 流動相體系。

首先考察了在70% 乙腈條件下9 種糖類化合物在Click TE-Cys 色譜柱上的保留時間。從圖2可以看出，極性最小的單糖最先被洗脫，二糖其次，極性最強的三糖最后被洗脫。

圖1 9 種糖類化合物的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structures of the nine carbohydrates

圖2 9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品在Click TE-Cys色譜柱上的分離譜圖Fig.2 Chromatogram of the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column

接著考察了流動相中水相比例變化對糖類化合物在Click TE-Cys 色譜柱上保留時間的影響。由圖3 可知，隨著水相比例的增加，溶質(zhì)的保留時間減少。在酸性條件下，除了唾液酸之外的糖類化合物的ln k（k 表示化合物的保留因子）與ln CB（CB表示水相的體積分?jǐn)?shù)）都呈線性關(guān)系。甲酸銨的pH值為3.35，在此條件下，Click TE-Cys 材料帶正電［11］，而中性糖不帶電，只有親水作用。唾液酸的pKa 值為2.6，唾液酸帶負(fù)電，唾液酸和Click TECys 材料既有靜電吸引作用又有親水作用，故唾液酸在Click TE-Cys 色譜柱上的保留比中性單糖強。由于唾液酸在Click TE-Cys 材料上受多種作用的影響，因此唾液酸的ln k 與ln CB不呈線性關(guān)系。

圖3 9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品在Click TE-Cys 色譜柱上的保留因子（k）隨流動相中水相比例（CB）變化的曲線Fig.3 Plots of retention factor（k）versus water content（CB）in mobile phase for the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column

本文研究結(jié)果表明，糖類化合物在Click TECys 色譜柱上按照極性由弱到強的順序依次洗脫，具有親水色譜的保留特點。

2.2 鹽濃度變化對糖類化合物在Click TE-Cys色譜柱上保留行為的影響

HILIC 的極性固定相與帶電荷的溶質(zhì)之間會發(fā)生靜電相互作用，導(dǎo)致色譜峰拖尾或變寬，影響溶質(zhì)在HILIC 色譜柱上的保留時間和選擇性［16-18］。因此常在流動相中添加一定濃度的緩沖鹽，用來調(diào)節(jié)樣品的保留時間和峰形［2］。本文考察了不同濃度甲酸銨條件下糖類化合物在Click TE-Cys 色譜柱上的保留時間的變化趨勢。從圖4 可以看出，當(dāng)流動相中沒有鹽時（pH ＝3.35），唾液酸和Click TECys 材料之間有靜電吸引作用。當(dāng)甲酸銨的濃度為10 mmol／L 時，Click TE-Cys 材料帶正電［11］，中性糖不帶電，唾液酸pKa ＝2.6，帶負(fù)電。由于流動相中的甲酸銨屏蔽了材料對唾液酸的靜電吸引作用，所以唾液酸和Click TE-Cys 材料之間的靜電吸引作用減弱，因此保留變?nèi)酢ｋS著鹽濃度的增加，除唾液酸之外的糖類化合物在Click TE-Cys 色譜柱上的保留時間增加。這是由于HILIC 的流動相中水相比例低，緩沖鹽會轉(zhuǎn)移到固定相表面吸附的水相中，增加了水層的厚度和極性，溶質(zhì)在水相中的分配系數(shù)增大，因此溶質(zhì)保留時間增加［1，13］。

圖4 9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品在Click TE-Cys 色譜柱上的保留因子（k）隨流動相中鹽濃度（Csalt）變化的曲線Fig.4 Plots of retention factor （k）versus salt concentration （Csalt）in mobile phase for the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column

2.3 糖類化合物在親水作用色譜模式下的保留方程

糖類化合物在HILIC 模式下的保留受多種作用的影響，如果符合分配機理，則ln k 與CB（流動相中水相的體積分?jǐn)?shù)）呈線性關(guān)系［19］；如果符合吸附機理，則ln k 與ln CB呈線性關(guān)系［20，21］。

從圖3 可以看出，根據(jù)吸附機理繪制的曲線，線性關(guān)系較好。根據(jù)吸附機理保留方程ln k ＝a ＋bln CB計算出a、b 值，判定系數(shù)達到0.900。其中，參數(shù)a 與溶質(zhì)和固定相之間的相互作用能、溶質(zhì)和流動相之間的相互作用能及溶質(zhì)分子體積相關(guān)；參數(shù)b 與固定相表面的溶質(zhì)分子頂替流動相中強洗脫相的分子數(shù)量相關(guān)。

本文應(yīng)用盧佩章等［22］提出的頂替-吸附液相色譜相互作用模型研究了糖類化合物在Click TE-Cys色譜柱上的保留行為，流動相中的強洗脫相和保留因子的關(guān)系如下：ln k ＝a＋bln CB＋cCB，其中，參數(shù)a與參數(shù)b 的意義與吸附機理保留方程ln k ＝a ＋bln CB中的a、b 相同；參數(shù)c 與流動相的作用能相關(guān)。用回歸方程ln k ＝a＋bln CB＋cCB對9 種糖類化合物在Click TE-Cys 色譜柱上的保留值進行多元線性回歸，可得到a、b、c 參數(shù)值，且判定系數(shù)R2多數(shù)都大于0.999（見表1）。結(jié)果表明可以用頂替-吸附液相色譜相互作用模型描述糖類化合物在Click TE-Cys 色譜柱上的保留行為。

表1 9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品在Click TE-Cys色譜柱上的回歸結(jié)果*Table 1 Regression Results of the nine carbohydrates on the Click TE-Cys column*

3 結(jié)論

本文以9 種糖類化合物標(biāo)準(zhǔn)品為樣品系統(tǒng)評價了糖類化合物在兩性離子HILIC 色譜柱Click TECys 上的保留行為，考察了有機相比例和鹽濃度對保留行為的影響，結(jié)果表明糖類化合物在Click TECys 色譜柱上的保留行為符合HILIC 的保留規(guī)律。采用頂替-吸附液相色譜相互作用模型對糖類化合物在上述HILIC 柱系統(tǒng)條件下的保留行為進行描述，其保留行為符合回歸方程ln k ＝a＋bln CB＋cCB，該結(jié)果有助于親水作用色譜材料的系統(tǒng)評價和評價方法的建立。

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