成曉東， 馮鈺锜

（生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，武漢大學(xué)化學(xué)系，湖北 武漢430072）

早在20 世紀(jì)90 年代，Alpert［1］第一次提出親水作用色譜（HILIC）的概念，并對其作了系統(tǒng)的闡述，但是在當(dāng)時并沒有引起重視。隨著代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、環(huán)境科學(xué)以及藥物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對極性小分子的分析已經(jīng)成為分析化學(xué)和生物化學(xué)研究的重要內(nèi)容，而傳統(tǒng)的反相色譜（RPLC）在分離這些極性分子時存在保留弱、分離選擇性差的缺點。正相色譜（NPLC）能較好地解決極性分子的保留與分離問題，但極性分子在NPLC 流動相中溶解度差、所用流動相與質(zhì)譜不兼容、色譜重現(xiàn)性差等因素制約了正相色譜在極性分子分離中的應(yīng)用。而HILIC為強極性和離子型化合物包括氨基酸、碳水化合物、極性藥物、多肽、天然產(chǎn)物等的分離分析提供了一個很好的選擇，近年來得到了很快的發(fā)展［2-5］。

伴隨著HILIC 的迅猛發(fā)展，越來越多的商品化HILIC 材料與學(xué)術(shù)報道的HILIC 材料種類越來越豐富。不同類型的固定相之間分離選擇性存在著很大的差異，應(yīng)用范圍也因此迥然不同［3，6-11］。因此，新型親水作用色譜材料的發(fā)展是促進親水作用色譜應(yīng)用與推廣的關(guān)鍵。

通常親水材料的制備是在材料的表面引入極性基團或者分子，而多元醇作為一種典型的具有較大極性的化合物，是制備親水材料的理想單體。巰基-乙烯基“點擊化學(xué)”方法有著條件溫和、選擇性好、產(chǎn)率高等優(yōu)點，且能避免傳統(tǒng)的疊氮-炔基“點擊化學(xué)”方法中重金屬的使用，近年來受到越來越多的關(guān)注［12］。我們利用含巰基的硅烷偶聯(lián)劑與含雙鍵的多元醇單體之間的點擊反應(yīng)制得含多元醇的功能化偶聯(lián)劑，并將此硅烷偶聯(lián)劑與硅膠反應(yīng)得到多元醇鍵合固定相。經(jīng)過元素分析對固定相進行了表征。考慮到固定相既具有極性多元醇官能團也有短的疏水碳鏈，在考察了固定相的親水性與疏水性后成功地將此固定相應(yīng)用于親水與反相色譜兩種模式，并對比了兩種模式下流速對于柱效的影響。最后將固定相應(yīng)用于烷基苯、水溶性維生素以及核苷的分離。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200 液相色譜系統(tǒng)（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA），由G1322A 脫氣機、G1311A 四元泵、G1329A 自動進樣器、G1315B DAD紫外檢測器以及G1330B 柱溫箱組成。元素分析由Vario EL III Universal CHNOS Elemental Analyzer（Elementar，Germany）測得。

硅膠（粒徑：5 μm；孔徑：10 nm；比表面積：300 m2／g）購 自Welch Materials，Inc. （Maryland，US）。巰丙基三甲氧基硅烷（MPS）購自武漢大學(xué)有機硅新材料公司。N-三羥甲基甲基丙烯酰胺（NA）、安息香二甲醚、核苷和堿基、維生素（B1、B2、B3、B3-amide、B6、B12）購自阿拉丁試劑。烷基苯、甲醇（MeOH）、三乙胺、乙腈（ACN）、乙酸、乙酸銨和甲酸銨購自上海國藥試劑廠。實驗所用的蒸餾水均取自成都艾柯純水儀。

1.2 多元醇鍵合固定相的制備

利用巰基與乙烯基的“點擊化學(xué)”反應(yīng)合成了含多元醇的硅烷偶聯(lián)劑，再將其引入到硅膠表面。圖1 為固定相的合成路徑。

首先制備了多元醇的硅烷偶聯(lián)劑，合成方法如下：將MPS （15 mmol）、NA （15 mmol）、安息香二甲醚（0.3 mmol）放入20 mL 的透明玻璃瓶中混合均勻。將玻璃瓶置于20 W 的紫外燈（波長為365 nm）照射的環(huán)境下，磁力攪拌反應(yīng)24 h。所得的透明液體即為多元醇功能化的硅烷偶聯(lián)劑。

接著將合成的硅烷偶聯(lián)劑與硅膠反應(yīng)。具體合成方法如下：將所合成的硅烷偶聯(lián)劑與5 g 硅膠分散于30 mL 無水甲苯中，N2保護下130 ℃回流反應(yīng)20 h 后過濾，分別用甲苯、甲醇、水和丙酮洗滌3次，置于60 ℃真空環(huán)境下干燥過夜，備用。

1.3 色譜柱的填裝和HPLC 條件

填裝：以甲醇作為淋洗劑，ACN／H2O（70% ／30%）混合液為勻漿劑，用裝柱機在41 MPa 壓力下填裝30 min，將所得的NAS 填料填入150 mm×4.6 mm 的不銹鋼色譜柱中。

圖1 三元醇丙烯酰胺（NAS）固定相的合成過程Fig.1 Synthesis procedure of the N-acryloyltris（hydroxymethyl）aminomethane-bonded silica （NAS）stationary phase

HPLC 條件：流速為1 mL／min；柱溫為35 ℃；檢測波長為254 nm 或230 nm；流動相為不同比例的有機溶劑與緩沖液的混合物。流動相使用前均經(jīng)過過濾與超聲脫氣處理。所有的測定均重復(fù)兩次以上。

2 結(jié)果和討論

2.1 固定相的表征

我們對不同批次的NAS 固定相進行了元素分析，結(jié)果如表1 所示。N 與S 的存在證明了NA 單體已成功引入到固定相表面，而不同批次間硅膠相似的元素組成則證明合成方法具有良好的重現(xiàn)性。

表1 NAS 填料的孔結(jié)構(gòu)表征與元素分析結(jié)果Table 1 Pore structure and elemental analysis of NAS stationary phase

2.2 溶質(zhì)保留機理的考察

一直以來，關(guān)于HILIC 的溶質(zhì)保留機理存在較大爭議，主流的觀點分為兩種。其中被大家廣泛接受的是Alpert 提出的分配機理［1］。該觀點認(rèn)為在分離過程中，極性固定相的表面會吸附流動相的水分子，使其在固定相表面形成水層，約4% ～13% 的硅膠孔體積會被水分子占據(jù)，而分析物會在水層與流動相之間達到一個分配平衡?；谶@種機理的研究衍生出了如下的理論模型［13］：

其中k 為溶質(zhì)保留因子，kw為僅用乙腈為流動相時分析物的保留因子，φ 為流動相中水的含量。而另一種觀點則是正相色譜中常見的吸附機理［14］。這種觀點認(rèn)為分析物在固定相的表面存在著一種吸附與解吸的過程。這種觀點早期不被大家所接受的原因是：通常正相色譜中流動相中是不含水的，因為水的極性較大，會迅速占據(jù)吸附位點導(dǎo)致分析物的保留減弱。而親水作用色譜的流動相中含有較多的水分子，如果分析物是通過吸附作用與固定相作用的話會被水分子迅速替換掉。然而隨著對HILIC 研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)氫鍵作用、偶極矩作用以及靜電作用均能與溶質(zhì)分子產(chǎn)生吸附作用，因此仍有不少人認(rèn)為HILIC 中吸附機理是存在的［8］。其保留因子與水含量之間的關(guān)系式為：

近年來隨著親水作用色譜的研究逐漸深入，一種新的多重保留機理被越來越多的人所接受［15］，其理論模型中保留因子與水含量之間的關(guān)系式為：

這種機理在含短碳鏈的極性固定相中較為常見，它被認(rèn)為是溶質(zhì)與碳鏈間的疏水作用以及其與固定相極性官能團之間的極性相互作用兩種作用共同產(chǎn)生的結(jié)果。其中m1衡量了疏水作用隨流動相中水含量上升的增強幅度，m2則衡量了親水作用隨水含量上升的削弱程度。核苷、酚類物質(zhì)以及水溶性維生素等分析物在HILIC 中的保留符合此種模型。

我們認(rèn)為親水色譜模式下的溶質(zhì)保留機理的不確定性與分析物本身的理化特性以及親水固定相結(jié)構(gòu)的多樣性分不開，分析物的結(jié)構(gòu)與固定相的結(jié)構(gòu)都會對兩者之間的相互作用產(chǎn)生影響。為了考察所合成的多羥基固定相的溶質(zhì)保留機理，我們選取了6 種核苷為分析物，考察了它們在固定相上的保留與流動相中水含量之間的關(guān)系，并按照上述的3 個方程對分析物的保留與水含量之間的關(guān)系進行了多重回歸分析。如表2 所示，分析物的保留因子與水含量之間的關(guān)系與方程（3）最為吻合，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。因此，固定相對于溶質(zhì)的保留是一種吸附與分配作用均存在的多重保留機理。

表2 不同理論模型下NAS 柱上分析物保留因子與流動相中水含量的線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients of the retention factors of the tested analytes on the NAS columns and water content in mobile phase using different equations

2.3 固定相親水性與疏水性的考察

固定相的結(jié)構(gòu)中包含短的疏水碳鏈以及極性多羥基基團，我們通過改變流動相中乙腈的含量來觀察分析物的保留時間變化，以此來考察固定相的親水性與疏水性。如圖2 所示，疏水性物質(zhì)苯、甲苯、萘在乙腈含量較低時有較強的保留，證明了固定相可以在疏水模式下應(yīng)用于這些弱極性化合物的分離。而在流動相中乙腈含量較高的情況下極性分析物的保留大大增強，證明固定相在此條件下具有較強的親水性。由于固定相的這種特性，使其能同時應(yīng)用于親水與反相色譜兩種模式。

圖2 分析物的保留因子隨流動相中乙腈含量變化的趨勢圖Fig.2 Plots of kvalues of the analytes vs. ACN volume fraction in mobile phase

2.4 反相與親水色譜模式下流速對柱效的影響

流動相流速對塔板高度有著非常重要的影響［16］。根據(jù)Van Deemter 方程，塔板高度與流速之間存在如下的關(guān)系［12］：

其中H 為塔板高度，A 為渦流擴散項，B／u 為縱向擴散相，Cu 為傳質(zhì)項，u 為流動相線速度。我們研究了兩種模式下流速對塔板高度的影響（見圖3），可以看出在RPLC 模式下，分析物的種類對塔板高度的影響很大，不同分析物之間塔板高度相差較大。而在HILIC 模式下，不同物質(zhì)的塔板高度相差不大。在較低流速下，由于縱向擴散嚴(yán)重，兩種模式下塔板高度均隨流速降低而有較大幅度升高。而在較高流速下，流速對于塔板高度的影響在兩種模式下差別較大。在RPLC 中，塔板高度變化隨流速變化較小。這就意味著在RPLC 中，可以適當(dāng)增加流動相流速，這樣可以在避免損失柱效的情況下有效減少分析時間。而在HILIC 中，較高流速下塔板高度隨流速增大而急劇升高。因此在HILIC 模式下，不提倡過多提高流速，柱效降低將會對分離效率造成較大影響。

2.5 應(yīng)用

2.5.1 水溶性維生素的分離

如圖4 所示，固定相對6 種水溶性維生素有較好的分離效果，展現(xiàn)了良好的親水性能。

圖3 反相與親水色譜兩種模式下固定相的Van Deemter 曲線Fig.3 Van Deemter plots on the NAS column in RPLC and HILIC mode

圖4 6 種水溶性維生素在NAS 固定相上的分離圖Fig.4 Separation of six water-soluble vitamins on the NAS column

2.5.2 烷基苯以及核苷分別在親水與反相色譜模式下的分離

如圖5 所示，將固定相應(yīng)用于親水與反相色譜兩種模式，分別對烷基苯以及核苷進行分離，均取得很好的分離效果，展示了固定相良好的應(yīng)用前景。

圖5 NAS 固定相上（a）烷基苯在RPLC 模式下與（b）核苷在HILIC 模式下的色譜圖Fig.5 Chromatograms of （a）alkylbenzenes under RPLC mode and （b）nucleosides under HILIC mode on the NAS column

3 結(jié)論

本文利用巰基與乙烯基的“點擊化學(xué)”反應(yīng)合成了含多元醇的硅烷偶聯(lián)劑，并將其引入到硅膠表面制得含多羥基的親水固定相。采用元素分析表征證明了多羥基官能團已成功鍵合到硅膠表面。研究了親水色譜模式下固定相的溶質(zhì)保留機理，表明固定相對溶質(zhì)具有多重保留機理?？疾炝斯潭ㄏ嗟氖杷耘c親水性，并成功地將固定相同時應(yīng)用于親水與反相色譜兩種模式，對比了反相色譜與親水色譜模式下流速對柱效的影響，結(jié)果表明親水色譜模式下高流速對柱效影響更大。最后將固定相應(yīng)用于水溶性維生素、烷基苯以及核苷的分離中，取得了較好的效果，證明該固定相擁有良好的應(yīng)用前景。

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