用 天， 吳 凡， 肖紅斌，2* ， 萬伯順*

（1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029）

親水作用色譜（HILIC）對強(qiáng)極性和親水性化合物具有很強(qiáng)的保留作用，作為反相液相色譜的一個重要補(bǔ)充，近些年受到越來越多的重視，業(yè)已廣泛應(yīng)用于各種極性和親水性化合物的分離，如多肽和蛋白質(zhì)［1，2］、糖類［2-5］、藥物［6-8］、代謝物［9，10］、抗體［11］、毒物［12］、天然產(chǎn)物［13］和環(huán)境污染物［14］等的分離。

固定相是色譜的核心技術(shù)之一，親水作用色譜固定相多以硅膠鍵合固定相為主，鍵合官能團(tuán)主要包括氨基、二醇基、氰基、酰胺型、環(huán)糊精型、糖型、兩性離子型和聚合物型等［15，16］，其中醇羥基具有不電離、穩(wěn)定性好和親水性強(qiáng)等優(yōu)點，是親水作用色譜固定相最優(yōu)秀的鍵合基團(tuán)之一。早期的醇羥基類親水作用色譜固定相是二醇基（diol）鍵合固定相，但是因其結(jié)構(gòu)中的醇羥基比例較小而表現(xiàn)出較弱的親水性和較強(qiáng)的疏水性［17-21］，在親水作用色譜領(lǐng)域的應(yīng)用相對有限。與二醇基鍵合固定相類似，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）鍵合固定相也表現(xiàn)出很強(qiáng)的疏水作用，其更多地應(yīng)用于混合（親水和反相）作用模式［17，22，23］。

為了克服早期醇羥基型親水作用色譜固定相親水性不足的缺點，近些年來相繼有多種多羥基型親水作用色譜固定相被開發(fā)出來，這些新型固定相因鍵合基團(tuán)中含有較多的醇羥基而表現(xiàn)出很強(qiáng)的親水性。2007 年，Liang 等［24-26］通過點擊反應(yīng)制備了葡萄糖（glucose）、麥芽糖（maltose）和β-環(huán)糊精（βcyclodextrin）修飾固定相，并成功將其應(yīng)用于糖的分離分析；其中麥芽糖鍵合固定相展現(xiàn)出了十分出眾的糖肽富集效應(yīng)［27］。2008 年，Irgum 等［28］通過表面引發(fā)聚合的方式制備了親水性更好的山梨糖醇（sorbitol）修飾固定相。2009 年，Huang 等［29］制備了殼寡糖（chitooligosaccharide）型固定相，并成功用于糖和糖肽的分離富集。2010 年，Marra 等［30］合成了半乳糖（ethynyl C-galactoside）和乳糖（propargyl O-lactoside）型親水作用固定相，成功分離了單糖和二糖差向異構(gòu)體。2011 年，Armstrong等［31，32］成功發(fā)展了基于環(huán)聚果糖6（cyclofructan 6）和硫酸化環(huán)聚果糖6 的新型親水作用色譜固定相。2011 年，Lindner 等［33］通過美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）將還原性糖鍵合于氨基硅膠表面而成功制備了纖維二糖（cellobiose）型固定相。

糖醇是一大類多羥基型化合物，作為糖的衍生物，具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性和親水性，十分有潛力作為親水作用色譜固定相的鍵合基團(tuán)，但目前除山梨糖醇已被應(yīng)用于親水作用色譜固定相外，鮮有文獻(xiàn)報道其他種類的糖醇型親水作用色譜固定相。為此，本文將線形的木糖醇（xylitol）和非線形的麥芽糖醇（maltitol）鍵合于硅膠表面，合成了兩種新型的多羥基類糖醇親水作用色譜固定相，并比較了兩種固定相在分離性能和選擇性上的異同。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 高效液相色譜儀（配紫外／可見光檢測器、自動進(jìn)樣器，美國Agilent 公司）；球形硅膠（粒徑5 μm，比孔容0.74 mL／g，比表面積324 m2／g，日本富士公司；使用前先用10% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的鹽酸活化6 h，并于140 ℃下真空干燥8 h 后備用）；乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；去離子水（電阻率＞18 MΩ·cm，美國Milli-Q 水處理系統(tǒng)制備）；異氰酸丙基三乙氧基硅烷（3-（triethoxysilyl）propylisocyanate，純度95%）、乙酸銨（色譜純）、乙酸（色譜純）、木糖醇（純度99%）、麥芽糖醇（純度95%）（上海阿拉丁試劑公司）；淫羊藿苷及其類似物（由本實驗室制備并提供）；吡啶（使用前用氫化鈣干燥處理）；其他試劑均為分析純并直接使用。

1.2 糖醇鍵合硅膠的制備

合成路線如圖1 所示。取5.0 g 干燥的木糖醇／麥芽糖醇溶于100 mL 無水吡啶中，加熱至80℃，由滴液漏斗滴加6.8／3.0 g 異氰酸丙基三乙氧基硅烷后繼續(xù)反應(yīng)6 h；待反應(yīng)液冷卻后加入6 g 干燥硅膠，回流反應(yīng)24 h；冷卻后抽濾，依次用適量的吡啶、乙醇、水、乙醇和丙酮洗滌，最后于60 ℃下真空干燥6 h 即得到糖醇鍵合硅膠。

圖1 木糖醇和麥芽糖醇鍵合硅膠的合成路線Fig.1 Synthesis route of xylitol／maltitol modified silica

1.3 色譜柱的填充及色譜分離條件

采用勻漿法將所制備的固定相裝入250 mm×4.6 mm 的不銹鋼色譜柱管中。乙酸銨水溶液的pH 用乙酸調(diào)節(jié)，死時間用甲苯測得，作為樣品的化合物質(zhì)量濃度為0.1 ～1 g／L。

2 結(jié)果與討論

2.1 元素分析和基本柱評價

元素分析給出木糖醇鍵合硅膠的碳、氫元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.76%、1.41%，麥芽糖醇鍵合硅膠的碳、氫元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.21%、1.51%。碳元素含量的增加有力地證明了通過圖1 所示的簡單合成方法可以將糖醇分子成功地鍵合于硅膠表面。利用公式S＝1 000×C／N×Mc（其中S 為糖醇基團(tuán)鍵合密度，單位為mmol／g；C 為碳元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；N為鍵合基團(tuán)中的碳原子數(shù)；對于木糖醇和麥芽糖醇鍵合基團(tuán)來說，N 分別為9 和16；Mc為碳原子的摩爾質(zhì)量）計算糖醇的鍵合密度分別為0.72 mmol／g和0.43 mmol／g，木糖醇的鍵合密度約為麥芽糖醇的1.7 倍，產(chǎn)生這種差異的原因是相對分子質(zhì)量較大的麥芽糖醇受到較大的空間位阻影響，因而鍵合密度明顯小于相對分子質(zhì)量較小的木糖醇。

利用3 種極性化合物（胸苷、胞嘧啶和鳥嘌呤）評價糖醇柱的保留能力、峰對稱性和柱效。它們在木糖醇柱上的保留因子（k）分別為1.82、13.85 和17.51，峰不對稱因子分別為0.79、0.91 和0.90，柱效約為16 000 N／m；在麥芽糖醇柱上的保留因子分別為2.06、11.22 和12.46，峰不對稱因子分別為0.65、0.67 和0.69，柱效在21 000 ～24 000 N／m 之間。上述結(jié)果表明這兩種糖醇柱對極性化合物都有很強(qiáng)的保留能力；相較之下，麥芽糖醇柱的柱效稍優(yōu)于木糖醇柱，但峰對稱性較木糖醇柱差，這是因為麥芽糖醇鍵合密度較低導(dǎo)致硅膠基質(zhì)表面殘留了較多的硅羥基。此外，在長時間使用中這兩種糖醇柱均表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性和重復(fù)性，如連續(xù)10 次進(jìn)樣分析，兩種糖醇柱的保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過0.3%。

2.2 流動相中乙腈含量對化合物色譜保留的影響

選擇10 種極性和親水性化合物作為測試樣品，通過增加流動相中乙腈的含量（5% （v／v，下同）～95%）研究糖醇柱的保留機(jī)理。如圖2 所示，在兩種糖醇柱上，乙腈含量對保留因子的影響皆呈J 形曲線，這是典型的親水作用色譜的保留曲線，一般認(rèn)為其保留機(jī)理為分配機(jī)理。曲線拐點在乙腈含量為40% 附近，當(dāng)乙腈含量小于40% 時，保留較弱且隨乙腈含量的降低并未出現(xiàn)明顯增加，而在親水作用色譜主導(dǎo)區(qū)域（乙腈含量大于40%），保留會隨乙腈含量的增加而顯著增強(qiáng)。與其他化合物不同的是，對氨基水楊酸和淫羊藿苷在麥芽糖醇柱上僅以親水作用為主（J 形曲線），但在木糖醇柱上表現(xiàn)為U 型曲線的特征，即親水作用色譜和反相色譜混合模式，這是因為木糖醇鍵合硅膠因OH／CH（CH2）基團(tuán)的摩爾比和極性基團(tuán)數(shù)目均小于麥芽糖醇鍵合硅膠而表現(xiàn)出了一定的疏水（反相色譜）作用。

圖2 流動相中乙腈含量對極性和親水性化合物在（a）木糖醇和（b）麥芽糖醇柱上的保留影響Fig.2 Effect of acetonitrile content in the mobile phase for the retention of polar and hydrophilic analytes on （a）xylitol and （b）maltitol columns

2.3 模型混合物的分離和選擇性比較

利用4 種極性／親水性模型混合物評估木糖醇柱和麥芽糖醇柱的分離性能，模型混合物包含酸性、堿性和中性化合物以及電解質(zhì)和非電解質(zhì)，其中堿基及其相應(yīng)的核苷是評估HILIC 柱最常用的模型化合物，利于與文獻(xiàn)中報道的其他HILIC 固定相進(jìn)行比較。圖3 ～6 為4 種模型混合物在優(yōu)化條件下的色譜圖。總體來看，木糖醇柱能夠很好地分離水溶性維生素、水楊酸及其類似物、堿基及其相應(yīng)的核苷，而淫羊藿苷類似物、胸腺嘧啶和尿嘧啶在木糖醇柱上不能達(dá)到基線分離；相比之下，麥芽糖醇柱對這4 種模型混合物均有良好的分離效果，僅僅腺苷和腺嘌呤在麥芽糖醇柱上不能得到基線分離。

對于大多數(shù)測試化合物，木糖醇柱和麥芽糖醇柱表現(xiàn)出大致相同的選擇性，只有維生素C 在木糖醇柱上先于維生素B3 洗脫，而在麥芽糖醇柱上后于維生素B3 洗脫（見圖3）。同時麥芽糖醇柱表現(xiàn)出對水楊苷獨特的選擇性，在相同的色譜條件下，水楊苷在木糖醇柱上的洗脫順序位于水楊酸和對氨基水楊酸之間，在麥芽糖醇柱上卻在對氨基水楊酸之后，甚至落后于乙酰水楊酸（見圖4）。考慮到非線形的麥芽糖醇分子比線形的木糖醇分子在化學(xué)結(jié)構(gòu)上多一個環(huán)狀的糖基，同時維生素C 和水楊苷在化學(xué)結(jié)構(gòu)上也恰恰比同組化合物多一個環(huán)狀（類）糖基結(jié)構(gòu)，據(jù)此推測上述兩點選擇性的差異很可能來源于麥芽糖醇上的糖基和分析物的糖基之間強(qiáng)烈的氫鍵作用。這種推測可以進(jìn)一步地被堿基及其相應(yīng)的核苷的分離結(jié)果證明：核苷相對于其相應(yīng)的堿基在分子結(jié)構(gòu)上僅多一個環(huán)狀糖基，以直鏈形的木糖醇柱為標(biāo)準(zhǔn)，選擇因子αmaltitol／αxylitol的計算值（見表1）均大于1。類似地，表1 中淫羊藿苷及其類似物的αmaltitol／αxylitol計算值均大于1，也同樣證明麥芽糖醇柱對環(huán)狀糖基獨特的選擇性。此外，堿基及其相應(yīng)的核苷在木糖醇和麥芽糖醇固定相上的洗脫順序明顯不同于其他多羥基型固定相［24，25，29，31，32］，說明其具有獨特的選擇性。

圖3 水溶性維生素在（a，b）木糖醇和（c）麥芽糖醇柱上的分離Fig.3 Separation of water soluble vitamins on（a，b）xylitol and （c）maltitol columns

圖4 水楊酸及其類似物在（a）木糖醇和（b，c）麥芽糖醇柱上的分離Fig.4 Separation of salicylic acid and its analogues on （a）xylitol and （b，c）maltitol columns

圖5 堿基及其相應(yīng)核苷在（a）木糖醇和（b）麥芽糖醇柱上的分離Fig.5 Separation of nucleic acid bases and nucleosides on （a）xylitol and （b）maltitol columns

圖6 淫羊藿及其類似物在（a）木糖醇和（b）麥芽糖醇柱上的分離Fig.6 Separation of icariin and its analogues on（a）xylitol and （b）maltitol columns

表1 一些化合物及其糖基衍生物在兩種糖醇柱上的選擇因子比較Table 1 Comparison of selectivities of the analytes and its glycosyl derivatives on xylitol and maltitol columns

2.4 流動相pH 的影響

通過改變流動相pH（4.2 ～6.8）考察其對糖醇柱保留的影響。木糖醇和麥芽糖醇鍵合基團(tuán)均為中性基團(tuán)，一般不會受流動相pH 變化的影響，流動相pH 主要影響固定相表面的殘余硅羥基（pKa≈4）和化合物的帶電狀態(tài)。一方面硅羥基會在較高的pH下逐漸解離而帶有更多的負(fù)電荷，進(jìn)而對帶電的化合物產(chǎn)生越來越強(qiáng)的靜電作用，另一方面化合物本身帶電狀態(tài)的改變會引起其親水性的變化。如圖7所示，在考察的pH 范圍內(nèi)，流動相pH 對木糖醇和麥芽糖醇柱的影響是相同的。當(dāng)pH 從4.2 增大至6.8 時，硅羥基和維生素C（pKa＝4.0）之間的靜電斥力因電離程度的增加而增大，趨向于保留減弱，同時維生素C 因進(jìn)一步電離而導(dǎo)致親水性增強(qiáng)，趨向于保留增加，由于前者的影響大于后者，總的結(jié)果是維生素C 的保留減弱。pH 對維生素B3 和朝藿定B 的影響與維生素C 類似。相反的，維生素B6（pKa＝5.0）的保留會隨著pH 的增大而略有增加，這是因為一方面硅羥基的進(jìn)一步電離有助于增加靜電引力，另一方面維生素B6 的電離會趨向于靜電引力和親水性的減弱，從實驗結(jié)果來看前一方面的原因略占優(yōu)勢。pH 對腺苷的影響與維生素B6 類似。對于水楊酸類化合物，pH 的增大會促進(jìn)其電離，一方面增強(qiáng)了與硅羥基的靜電斥力，另一方面增加了化合物的親水性，對于水楊酸和對氨基水楊酸，前者的影響稍強(qiáng)于后者，故其保留略有減弱；而對于3，4-二羥基苯乙酸，前者的影響遠(yuǎn)不及后者，因而保留顯著增加。另外，通過比較不同pH 下淫羊藿類似物的αmaltitol／αxylitol值（見表2），發(fā)現(xiàn)隨著流動相pH 的增加，麥芽糖醇柱對糖基的選擇性會有一定程度的增強(qiáng)。此外，流動相pH 的變化可以有效地改善糖醇柱的分離效果，如圖3a 和3b 所示，維生素B2 和B6 的分離度隨pH 的減小而稍有增加。

圖7 （a）木糖醇和（b）麥芽糖醇柱上流動相pH 對化合物色譜保留的影響Fig.7 Effect of mobile phase pH for the retention factors of the analytes on （a）xylitol and （b）maltitol columns

表2 流動相pH 對糖基在麥芽糖醇柱上保留的影響Table 2 Effect of mobile phase pH for the retention of glycosyl on the maltitol column

2.5 緩沖鹽濃度的影響

通過增加流動相中乙酸銨的濃度（5 ～40 mmol／L）考察緩沖鹽濃度對保留的影響。如圖8所示，在兩種糖醇柱上緩沖鹽濃度對化合物保留的影響是相同的，即化合物的保留均隨著緩沖鹽濃度的增加而增強(qiáng)。

圖8 （a）木糖醇和（b）麥芽糖醇柱上緩沖鹽濃度對化合物保留的影響Fig.8 Effect of buffer salt concentration for the retention of analytes on （a）xylitol and（b）maltitol columns

一般來說，流動相中緩沖鹽濃度的增加一方面會引起吸附在固定相表面的水化層變厚而趨向于保留增強(qiáng)，另一方面也會引起更多的銨離子吸附在硅羥基表面，進(jìn)而降低了硅羥基的平均帶電量，導(dǎo)致其對分析物的靜電斥力（或引力）減弱，趨向于保留增強(qiáng)（或減弱）。在糖醇柱上，對于中性的水楊苷來說，保留增強(qiáng)源于水化層的變厚；對于帶負(fù)電的化合物如朝藿定B、對氨基水楊酸和維生素C 來說，保留增強(qiáng)是水化層增厚和靜電斥力減弱共同作用的結(jié)果；對于帶正電的化合物如維生素B2 和尿嘧啶來說，水化層增厚的影響大于靜電引力減小的影響，總的作用結(jié)果仍是保留增強(qiáng)。另外，通過比較不同乙酸銨濃度下淫羊藿類似物的αmaltitol／αxylitol值（見表3），發(fā)現(xiàn)隨著緩沖鹽濃度的增加，麥芽糖醇柱對糖基的選擇性變化不明顯。此外，利用流動相中緩沖鹽濃度的變化同樣可以很好地改善糖醇柱的分離效果，甚至改變其選擇性，如圖4b 和4c 所示，在麥芽糖醇柱上水楊酸類化合物的分離度均隨著乙酸銨濃度的增大而顯著增加，洗脫順序也會發(fā)生部分改變。

表3 緩沖鹽濃度對糖基在麥芽糖醇柱上保留的影響Table 3 Effect of buffer salt concentration for the retention of glycosyl on the maltitol column

3 結(jié)論

本文制備了兩種糖醇類新型多羥基親水作用色譜固定相，這兩種固定相對酸、堿和中性化合物以及電解質(zhì)和非電解質(zhì)，均表現(xiàn)出了良好的分離性能和較為新穎的選擇性，特別是麥芽糖醇鍵合固定相顯示出對糖基的獨特選擇性。這兩種固定相為分離分析極性和親水性化合物提供了新的可供選擇的色譜固定相，具有很好的應(yīng)用前景。

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