高 慧， 許媛媛，， 孫 麗， 金忠秀， 胡海婷，盛 杰， 任玲玲， 陶芳標(biāo)，*

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)系，安徽 合肥230032；2. 安徽人口健康與優(yōu)生省級實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230032）

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一類具有軟化作用的化合物，全球每年消耗量高達(dá)幾百萬噸［1］。主要用作塑化劑，廣泛用于食品包裝、醫(yī)療器械、家居裝飾、兒童玩具以及個人護(hù)理產(chǎn)品中［2］。PAEs 在使用過程中極易釋放，已普遍存在于大氣、水體、食物等多種環(huán)境介質(zhì)中。人類主要通過消化道、呼吸道、靜脈注射和皮膚接觸等途徑暴露［2］，在體內(nèi)迅速水解為生物活性增強(qiáng)的單酯，可進(jìn)一步發(fā)生氧化或羥基化反應(yīng)［3，4］。這些代謝產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)源性葡萄糖醛酸化以增加水溶性，主要經(jīng)尿液排出體外［3］。因此，目前尿液中代謝物常作為相應(yīng)PAEs 的生物標(biāo)志物，評估近期暴露水平［3，4］。研究表明，PAEs 具有潛在的生殖和發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性［5］、甲狀腺毒性以及增加兒童哮喘和過敏風(fēng)險等，危害人類健康。可見，建立準(zhǔn)確、靈敏的暴露評估方法，對今后的健康研究和衛(wèi)生政策制定至關(guān)重要。

國內(nèi)對飲食［6-8］、化妝品［9］、土壤［10］等樣品中PAEs 的檢測方法報道較多，但尿液中PAEs 代謝物的實(shí)驗(yàn)檢測方法多為國外學(xué)者建立，國內(nèi)報道較少［11］。目前常見的人類尿液PAEs 代謝物檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法、高效液相色譜（HPLC）法［12-15］和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS／MS）法等［11，16］。本實(shí)驗(yàn)室建立了同時檢測尿液中7 種PAEs 代謝物的高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS／MS）分析方法，操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為今后評價人類多種PAEs 暴露水平及健康科學(xué)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1200 HPLC-6410 MS Agilent 液相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用儀，配電噴霧離子源（美國Agilent 公司）；Oasis?MAX（3 mL／60 mg）SPE 小柱（美國Waters 公司）；N-EVAP-122 氮吹儀（美國Organomation 公司）；美國Millipore 純水儀；SK-1 快速混勻器（金壇市科技儀器有限公司）；HZS-H 電熱恒溫水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

LC-MS 級甲醇、乙腈和水均購自美國Honeywell 公司；β-葡萄糖醛酸酶、LC-MS 級無水乙酸、分析純醋酸銨均購于美國Sigma-Aldrich 公司；分析純氨水、色譜級無水甲酸均購于西隴化工股份有限公司。

鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品原液（100.0 mg／L，純度≥99%）：鄰苯二甲酸單甲酯（MMP 和13C-MMP）、鄰苯二甲酸單乙酯（MEP 和13C-MEP）、鄰苯二甲酸單丁酯（MBP 和13C-MBP）、鄰苯二甲酸單芐酯（MBzP 和13C-MBzP）、鄰苯二甲酸-單-乙基己基酯（MEHP 和13C-MEHP）、鄰苯二甲酸-單-（2-乙基-5-羥基己基）酯（MEHHP 和13C-MEHHP）和鄰苯二甲酸-單-（2-乙基-5-酮基己基）酯（MEOHP 和13CMEOHP），均購于美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

準(zhǔn)確量取MMP、MEP、MBP、MBzP、MEHP、MEHHP 和MEOHP 及其13C 標(biāo)記單酯的標(biāo)準(zhǔn)品原液1 mL 于10 mL 容量瓶中，乙腈定容，配制為10.0 mg／L 的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液和內(nèi)標(biāo)單標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

準(zhǔn)確量取10.0 mg／L 各單標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 于同一10 mL 容量瓶中，乙腈定容，配制1.0 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；同時配制1.0 mg／L 的內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，操作步驟同上。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)定容液配制

準(zhǔn)確量取1.0 mg／L 內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL于干凈的50 mL 容量瓶中，加入LC-MS 級乙腈9 mL，LC-MS 級水定容，配制為20.0 μg／L 的混合內(nèi)標(biāo)定容液。

1.2.4 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確量取1.0 mg／L 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2 mL 于10 mL 容量瓶中，加入0.2 mL 內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.0 mg／L），LC-MS 級水定容，配制為200.0 μg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；此后逐級稀釋，采用20.0 μg／L 混合內(nèi)標(biāo)定容液定容，配制100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.2 μg／L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，保證溶液中13C-內(nèi)標(biāo)物濃度均為20.0 μg／L。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件與方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Phenyl（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：A 相為0.1% （v／v，下同）乙酸水溶液，B 相為0.1% 乙酸乙腈溶液。洗脫梯度：0 ～8 min，20%B ～50%B；8 ～13 min，50%B ～60%B；13 ～17 min，60% B；17 ～19 min，60% B ～90%B；19 ～21 min，90% B；21 ～23 min，90% B ～20% B；23 ～27 min，20% B。流速為0.2 mL／min；柱溫35 ℃；連續(xù)自動進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-）；毛細(xì)管電壓為4 000 V；霧化氣壓力為275.8 kPa，干燥氣溫度為300 ℃，流速為9.0 L／min；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測；碰撞氣和載氣均為高純氮?dú)狻? 種PAEs 及其內(nèi)標(biāo)物的定量離子對、保留時間、碎裂電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7 種鄰苯二甲酸單酯及其內(nèi)標(biāo)的特征離子對、碎裂電壓、碰撞能量和保留時間等質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Precursor and product ion transitions，fragmentors，collision energies and retention times （RT）of the native and labeled seven phthalate metabolites

1.3.3 尿液的收集與處理

孕婦晨尿收集于馬鞍山市婦幼保健院，采用聚丙烯尿杯收集，經(jīng)轉(zhuǎn)速3 500 r／min 離心10 min 后，取上清液于聚丙烯尿管中，-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時，取出冷凍儲存的尿液，在室溫條件下緩慢解凍，經(jīng)轉(zhuǎn)速3 500 r／min 離心10 min 后，取上清尿液1 mL 于玻璃試管中，分別加入200 μL 乙酸銨緩沖液（1 mol／L，pH 5.0）、50 Units β-葡萄糖醛酸酶和4 μL 內(nèi)標(biāo)混合工作液（1.0 mg／L），蓋上玻璃蓋，渦旋混勻后于37 ℃水浴振蕩120 min。固相萃取小柱經(jīng)3 mL 甲醇和3 mL 水活化后，將酶解處理后的尿樣上樣，再分別采用5% 氨水溶液、純甲醇和2% 甲酸-40% 甲醇-水溶液淋洗，最后采用2% 甲酸-甲醇溶液洗脫。洗脫液經(jīng)55 ℃水浴氮吹至微潤后以0.2 mL 體積比為1 ∶4 的乙腈和水溶液定量復(fù)溶，供HPLC-MS／MS 分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿液前處理過程優(yōu)化

2.1.1 酶添加量的優(yōu)化

尿液中PAEs 代謝產(chǎn)物以游離態(tài)和葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)兩種形式存在，且部分代謝物的結(jié)合態(tài)所占比例較高，因此對樣品進(jìn)行去葡萄糖醛酸基的酶解處理十分必要。根據(jù)文獻(xiàn)［11］，確定解離酶為β-葡萄糖醛酸酶，酶解溫度為37 ℃。文獻(xiàn)報道的解離酶溫育時間60 ～120 min、酶解環(huán)境pH 5.0 ～7.0、酶適宜用量各不相同。選取一份志愿者晨尿，分別將尿液酸化為pH 5.0、6.0、6.5 和7.0，添加足夠酶量后溫育120 min，發(fā)現(xiàn)pH 5.0 的環(huán)境中，酶解效果最佳（見圖1）。確定尿液的適宜酸環(huán)境為pH 5.0 后，在另一志愿者各等份尿液中各加入酶量0、5、50 和100 Units 分別溫育60、90、120 min 進(jìn)行酶解，以MBP 測定結(jié)果為指標(biāo)。結(jié)果（見圖2）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶添加量為50 Units 并溫育120 min 時，與酶添加量為100 Units 的MBP 測定結(jié)果無統(tǒng)計(jì) 學(xué) 差 異（p ＝0.070），綜合考慮時間和成本，確定樣品酶解處理的酶適宜用量為50 Units，溫育時間為120 min。

圖1 志愿者尿液在pH 5.0 ～7.0 酸化處理后MBP、MEHP、MEHHP 和MEOHP 的質(zhì)量濃度（μg／L）Fig.1 Mass concentrations of MBP，MEHP，MEHHP and MEOHP in volunteer urine after acidification at pH 5.0-7.0 levels

圖2 志愿者尿液在不同的酶添加量和溫育時間處理后MBP 的質(zhì)量濃度Fig.2 Mass concentrations of MBP in volunteer urine after processing with various amounts of glucuronidase enzyme and at various incubation times

2.1.2 凈化條件優(yōu)化

通過比較Waters OASIS?HLB 柱（3 mL／60 mg）和MAX 柱（3 mL／60 mg）的萃取效果，確定采用MAX 柱進(jìn)行固相萃取。這是由于MAX 柱為混合陰離子交換柱，具有陰離子交換和反相吸附兩種模式，因此本次實(shí)驗(yàn)采用了3 個步驟進(jìn)行淋洗。在上樣后采用5% 氨水（淋洗液A）過柱，促進(jìn)酸性的鄰苯二甲酸單酯化合物離子化，提高其在MAX 柱的保留水平；再用純甲醇（淋洗液B）淋洗減少有機(jī)雜質(zhì)；2% 甲酸-40% 甲醇-水溶液（淋洗液C）淋洗去除酸性雜質(zhì)且調(diào)節(jié)柱的酸堿度，便于洗脫；最后采用2% 甲酸-甲醇溶液洗脫。通過比較不同使用量的洗脫劑（1 ～6 mL），發(fā)現(xiàn)洗脫劑≥3 mL 時洗脫效果相似；考察淋洗液C 中不同甲醇含量（0 ～50% ）的淋洗效果，發(fā)現(xiàn)使用20% ～40% 甲醇的淋洗液C 時，7種PAEs 代謝物的回收率較好。為了更多地去除雜質(zhì)，認(rèn)為選擇甲醇含量為40% 的淋洗液C 最合適（見圖3）；最后比較了淋洗液A、B 和C 不同配比的淋洗效果，發(fā)現(xiàn)采用1 mL 淋洗液A、1.5 mL 淋洗液B 和1 mL 淋洗液C 的淋洗程序時回收率最佳（見圖4）。

2.1.3 樣品處理過程優(yōu)化

為了避免塑料產(chǎn)品中塑化劑遷移污染，尿液處理材料均為玻璃制品，現(xiàn)洗現(xiàn)用。經(jīng)重鉻酸洗液過夜浸泡至少12 h，采用高純水反復(fù)洗滌后，用LCMS 級甲醇潤洗兩遍，高溫180 ℃烘1 h 備用。每一批次樣品處理的同時，采用LC-MS 級水做兩個平行空白樣品，用于本底值扣除，以降低批次間的誤差。

圖3 采用不同甲醇含量（0 ～50%）的淋洗液淋洗后7 種PAEs 代謝物的加標(biāo)回收率Fig.3 Recoveries of the seven phthalate metabolites after washing by the solutions of 0-50% methanol-2% acetic acid in water

圖4 采用不同體積配比的5%氨水溶液、純甲醇和2%甲酸-40%甲醇-水溶液淋洗程序的7 種PAEs 的加標(biāo)回收率Fig.4 Recoveries of the seven phthalate metabolites after processing with various eluting procedures

2.1.4 內(nèi)標(biāo)法定量

采用外標(biāo)法定量檢測時，7 種PAEs 代謝物的回收率極低（數(shù)據(jù)略）；選擇理化特征相似的13C-同位素作為內(nèi)標(biāo)物，不僅能夠準(zhǔn)確提供定性和定量信息，而且能有效避免樣品基質(zhì)影響，校正方法中出現(xiàn)的誤差，顯著提高檢測方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和精密度。

2.2 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，PAEs 代謝物在苯基柱上的峰形及分離效果更好［15，17］，因此本實(shí)驗(yàn)室采用ZORBAX SB-Phenyl 柱進(jìn)行分離。PAEs 代謝物是一類具有極性差異的羧基化合物，在流動相中加入一定量的乙酸，抑制羧基解離，可促進(jìn)其在反相柱上的保留。采用含0.1% 乙酸的乙腈-水體系作為流動相，通過梯度洗脫改變流動相的極性使混合物得到更好的分離。在8.0 ～17.0 min 時，0.1% 乙酸-乙腈溶液的濃度梯度增加緩慢，使MEOHP、MEHHP、MBP 和MBzP 4 種難分離代謝物的分離效果較好。用乙腈配制質(zhì)量濃度為1.0 mg／L 的7 種PAE 代謝物單標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用HPLC-MS／MS 自動優(yōu)化，獲取靈敏度高、穩(wěn)定性好的MRM 檢測離子對，優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表1。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限

準(zhǔn)確量取適量的PAEs 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.0 mg／L），用乙腈-水（2 ∶8，v／v）稀釋，獲得質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 和200.0 μg／L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（13C-內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為20.0 μg／L）。實(shí)驗(yàn)表明，鄰苯二甲酸單酯在0.2～200.0 μg／L 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)定量離子的相對峰面積比值（y）與質(zhì)量濃度（x）的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 76，檢出限（LOD，S／N＝3）和定量限（LOQ，S／N ＝10）范圍分別是13.43 ～80.21 ng／L 和44.77 ～267.37 ng／L（見表2）。

表2 尿液中7 種PAEs 代謝物的線性范圍、回歸方程、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges，regression equations，LODs and LOQs of the seven phthalate metabolites in human urine

2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

取空白尿液數(shù)等份，分別加入不等量的7 種PAEs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成加標(biāo)量為5.0、50.0 和200.0 μg／L 的樣品，每個濃度平行6 個樣品，按照前述方法處理和分析樣品，計(jì)算回收率?？瞻啄蛞杭凹訕?biāo)尿液（加標(biāo)量為200 μg／L）的HPLC-MS／MS總離子流圖（TIC）和MRM 譜圖見圖5。

圖5 （a）空白尿液及（b）加標(biāo)尿液（加標(biāo)量為200 μg／L）中7 種PAEs 代謝物的總離子流圖（TIC）和MRM 譜圖Fig.5 Total ion chromatograms （TIC）and MRM chromatograms of a mixture of the seven phthalate metabolites in （a）a non-spiked and （b）spiked （200 μg／L）human urines

分別在樣品處理當(dāng)日不同時間點(diǎn)和不同處理天數(shù)進(jìn)樣分析（n ＝6），計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。在每次進(jìn)樣結(jié)束后，將樣品溶液更換密封墊密封，并于-20 ℃儲存，以減少揮發(fā)和便于下次進(jìn)樣檢測?；厥章屎途芏冉Y(jié)果見表3。

表3 尿中7 種PAEs 代謝物在3 個加標(biāo)水平的加標(biāo)回收率、日內(nèi)和日間精密度（n＝6）Table 3 Recoveries，inter-day and intra-day precisions of the seven phthalate metabolites in a urea sample at three spiked levels （n＝6）

2.4 實(shí)際樣品檢測

2014 年9 月以來，本實(shí)驗(yàn)室采用該方法對800份孕婦尿樣進(jìn)行了7 種PAEs 代謝物的檢測，結(jié)果表明，除MBzP 檢出率為81.5% 外，其他6 種PAEs代謝物的檢出率均高于98.3%，如表4 所示。本方法具有良好的實(shí)用性，可應(yīng)用于人類多種PAEs 暴露水平的評估檢測。

表4 孕婦尿樣中7 種PAEs 代謝物的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of the seven phthalate metabolites in pregnant urine samples

3 結(jié)論

本文建立了同時測定人尿液中7 種PAEs 代謝物的HPLC-MS／MS 分析方法。本文考察了酶的適宜酸環(huán)境、酶用量、酶解時間和淋洗程序等，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。本方法操作簡便，結(jié)果可靠，檢出限低，重現(xiàn)性好，已應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)室的生物樣本檢測，為今后人類PAEs 暴露評估和相關(guān)健康研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］ Halden R U. Annu Rev Health，2010，31：179

［2］ Schettler T. Int J Androl，2006，29（1）：134

［3］ Frederiksen H，Skakkebaek N E，Andersson A M. Mol Nutr Food Res，2007，51（7）：899

［4］ Wittassek M，Angerer J. Int J Androl，2008，31（2）：131

［5］ Miodovnik A，Edwards A，Bellinger D C，et al. Neurotoxicology，2014，41：112

［6］ Sun X，Qi L，Qin T T，et al. Chinese Journal of Chromatography （孫欣，齊莉，秦廷亭，等. 色譜），2014，32（11）：1260

［7］ Zhang F，Li Z H，Zhang Y，et al. Chinese Journal of Chromatography （張帆，李忠海，張瑩，等. 色譜），2014，32（7）：735

［8］ Lu L，Gong X，F(xiàn)eng Y L. Chinese Journal of Chromatography （蘆麗，宮旭，馮有龍. 色譜），2014，32（11）：1286

［9］ Liang J，Zhuang W E，Wei D Q，et al. Chinese Journal of Chromatography （梁婧，莊婉娥，魏丹琦，等. 色譜），2012，30（3）：273

［10］ Li H，Tian F L，Ren X D，et al. Chinese Journal of Chromatography （李紅，田福林，任雪冬，等. 色譜），2011，29（6）：563

［11］ Zhu X N，Wang G Q，Wu C H，et al. Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases （朱效寧，汪國權(quán)，鄔春華，等. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志），2014，32（6）：464

［12］ Wu C H，Zheng L X，Zhou Z J. Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases （鄔春華，鄭力行，周志俊. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志），2008，26（8）：494

［13］ Wang W，Guo X，Wen F，et al. Journal of Environment and Health （王瑋，郭欣，聞福，等. 環(huán)境與健康雜志），2011，28（8）：711

［14］ Lin X T，Wang X Y，Xia D G，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （林興桃，王小逸，夏定國，等. 分析化學(xué)），2011，39（6）：877

［15］ Dai J J，Yang K F，Jiang L L，et al. Journal of Shanghai Jiaotong University：Agricultural Science（代娟娟，楊科峰，蔣磷蕾，等. 上海交通大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2014，32（4）：82

［16］ Hu X J，Zhang M，Xu X Y，et al. Journal of Hygiene Research （胡小健，張淼，徐肖雅，等. 衛(wèi)生研究），2012，41（1）：109

［17］ Silva M J，Slakman A R，Reidy J A，et al. J Chromatogr B，2004，805：161