胡貝貞， 董文洪， 夏碧琪， 宋偉華， 韓 超*

（1. 紹興出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 紹興312000；2. 溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 溫州325027）

黃酒是我國(guó)的傳統(tǒng)釀造酒，其中含有功能性氨基酸和肽類、糖類（低聚糖為主）、無(wú)機(jī)元素、多酚等多種對(duì)人體有益的生物活性成分，這些組分賦予了黃酒獨(dú)特的保健功能，其功用和價(jià)值得到了廣泛認(rèn)可。近年來(lái)，已有較多研究機(jī)構(gòu)開展了黃酒功效和有益成分的研究［1，2］。糖類是黃酒中的主要成分之一，主要來(lái)源于生產(chǎn)過(guò)程中未完全發(fā)酵的殘?zhí)呛秃?］，其中含量最高的是葡萄糖，其次是潘糖、麥芽糖、異麥芽糖等低聚糖，它們賦予了酒液甜味和黏稠的口感。由于發(fā)酵工藝上的差別，不同品種的黃酒按含糖量高低可分為干型、半干型、半甜型、甜型4類［4］，攝取低聚糖對(duì)人體健康有益。目前測(cè)定黃酒中糖類的標(biāo)準(zhǔn)方法均是測(cè)定總糖含量的化學(xué)滴定方法，結(jié)果以葡萄糖含量計(jì)，僅有少量?jī)x器分析的研究［5-7］對(duì)低聚糖進(jìn)行了測(cè)定，研究結(jié)果不是很全面和深入。

目前針對(duì)食品中糖含量測(cè)定的儀器分析方法主要有液相色譜-示差折光法［8］、液相色譜-蒸發(fā)光散射法［9］、液相色譜-質(zhì)譜法［10，11］和離子色譜-脈沖安培法［12-14］等。糖類化合物具有弱酸性及親水性，在比較強(qiáng)的堿性溶液中以陰離子形態(tài)存在，其還原性為直接進(jìn)行安培檢測(cè)提供了可能［15］，近年來(lái)離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法已成為分析該類物質(zhì)的主流方法［16-20］。本文在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了黃酒中主要單糖和低聚糖的離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法，對(duì)色譜條件和前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，并將所建立的方法用于不同含糖量的紹興黃酒的檢測(cè)。

指紋圖譜是指經(jīng)光譜或色譜測(cè)定得到的組分群體的特征圖譜或圖像，建立指紋圖譜能較為全面地反映產(chǎn)品中所含的化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)［21］。指紋圖譜技術(shù)近年來(lái)也越來(lái)越多地運(yùn)用于酒的檢測(cè)中，主要集中在葡萄酒［22］和白酒［23，24］行業(yè)，該技術(shù)在黃酒檢測(cè)中的應(yīng)用報(bào)道較少。本文選取幾家紹興酒生產(chǎn)企業(yè)不同批次、不同年份的加飯酒進(jìn)行檢測(cè)，基于所得的檢測(cè)結(jié)果，利用中位數(shù)法構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，并采用夾角余弦法評(píng)價(jià)了各個(gè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的相似度，初步分析了以相似度鑒別不同廠家酒的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS-5000 型離子色譜儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司），配備ED5000 電化學(xué)檢測(cè)器、Au工作電極、pH-Ag／AgCl 復(fù)合參比電極、Chromeleon6.8 色譜工作站、AS-AP 自動(dòng)進(jìn)樣器。CarboPacTM10 保護(hù)柱（50 mm×4 mm），CarboPacTM10分析柱（250 mm×4 mm）。SYNERY 型超純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore 公司）。

D-葡 萄 糖（純 度99.5%）、D-果 糖（純 度99.5%）、D-麥芽糖（純度99%）、麥芽三糖（純度98.6%）購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司，異麥芽糖（純度＞97%）、異麥芽三糖（純度＞97%）、潘糖（純度＞98%）購(gòu)于東京化成工業(yè)株式會(huì)社；50% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的氫氧化鈉（NaOH）溶液、電化學(xué)分析用醋酸鈉（NaOAc）購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司；C18固相萃取柱：1 000 mg／6 mL（德國(guó)MN 公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；實(shí)驗(yàn)用水均采用電阻率不低于18.2 MΩ·cm 的超純水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別稱取各種糖100 mg，用超純水溶解并定容至100 mL 容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1 g／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冷凍保存。使用前取出解凍，取等量同濃度級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 淋洗液

250 mmol／L NaOH 溶液：取50% 的NaOH 溶液20 g，用水稀釋定容至1 L，混勻后立即通氮?dú)猓?5 000 Pa）保護(hù)。

200 mmol／L NaOAc 溶液：稱取16.4 g 固體醋酸鈉，用水溶解后稀釋定容至1 L，混勻后立即通氮?dú)猓?5 000 Pa）保護(hù)。

1.3 樣品前處理

取C18固相萃取柱，依次用6 mL 甲醇、6 mL 超純水活化，備用。取0.5 mL 黃酒樣品，用超純水稀釋定容至100 mL，待凈化。取2 mL 待凈化液加到已活化好的小柱上，棄去流出液，再加2 mL 待凈化液至小柱上，收集流出液，過(guò)0.22 μm 尼龍濾膜后供儀器檢測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱：CarboPacTM10 保護(hù)柱（50 mm×4 mm）和CarboPacTM10 分析柱（250 mm×4 mm），柱溫為30 ℃。以超純水（A）、250 mmol／L NaOH（B）和200 mmol／L NaOAc（C）為淋洗液進(jìn)行洗脫，梯度洗脫程序?yàn)椋? ～2.0 min，82% A，18% B；2.0 ～11.0 min，82% A ～72% A，18% B，0 ～10% C；11.0 ～20.0 min，72% A ～62% A，18% B，10% C ～20% C；20.0 ～30.0 min，62% A ～52% A，18% B，20% C ～30% C；30.0 ～32.0 min，52% A ～32% A，18% B，30% C ～50% C；32.1 ～37.0 min，20% A，80% B；37.1 ～42.0 min，82% A，18% B。流速為1.0 mL／min，進(jìn)樣量為25 μL，檢測(cè)方式為四電位脈沖安培檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖見圖1b。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液濃度及淋洗梯度的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了僅使用NaOH 作淋洗液（見圖1a）和搭配使用NaOH、NaOAc 作淋洗液（見圖1b）的分離效果。結(jié)果顯示，僅使用NaOH 作淋洗液時(shí)，各物質(zhì)色譜峰的對(duì)稱性較差，后流出的物質(zhì)出峰較晚，且展寬較嚴(yán)重；而同時(shí)加入NaOAc 并逐漸提高其洗脫濃度后，各物質(zhì)峰形對(duì)稱且出峰時(shí)間更合理，故本實(shí)驗(yàn)采用1.4 節(jié)的洗脫條件，在梯度洗脫中加入NaOAc 并逐漸提高濃度以提升其對(duì)后流出糖類的洗脫能力。

圖1 不同淋洗液洗脫條件下糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of saccharide standard solution with different eluents

本實(shí)驗(yàn)還考察了不同比例的NaOH 以及NaOAc 加入時(shí)間對(duì)各種糖類洗脫效果的影響。結(jié)果顯示，隨著NaOH 淋洗濃度的加大及NaOAc 加入時(shí)間的提前，各物質(zhì)出峰時(shí)間提前，峰形不同程度地變得尖銳，但是葡萄糖和果糖的分離度有所下降，當(dāng)NaOH 淋洗濃度為125 mmol／L 時(shí)，兩者未達(dá)到基線分離。當(dāng)NaOH 淋洗濃度為75 mmol／L 時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中葡萄糖和果糖剛達(dá)到基線分離；而在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)還發(fā)現(xiàn)，樣品中緊接著葡萄糖有一個(gè)雜質(zhì)出峰，無(wú)法與果糖有效分離，而NaOH 淋洗濃度為45 mmol／L 時(shí)，果糖與該雜質(zhì)能有效分離，故本方法最終選用1.4 節(jié)的洗脫條件（NaOH 淋洗濃度為45 mmol／L）作為最終的洗脫程序。

2.2 線性關(guān)系、定量限

準(zhǔn)確配制含量分別為0.5、2、5、10、25、50 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 節(jié)的條件進(jìn)行分析，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，結(jié)果顯示：各種糖在0.5 ～50 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.998 0 ～0.999 2 之間。各物質(zhì)的線性方程及相關(guān)系數(shù)（R2）見表1。

表1 各物質(zhì)的保留時(shí)間、線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Retention times，linear equations and correlation coefficients （R2）of the analytes

本方法的定量限（LOQ）根據(jù)信噪比大于10 計(jì)算得出，以各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在樣品基體中的響應(yīng)低限0.5 mg／L 計(jì)，乘以樣品稀釋倍數(shù)200 倍，得定量限為0.1 g／L。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

選取一個(gè)糖本底含量較低的酒作加標(biāo)回收率試驗(yàn)的樣品，分別添加0.8、2.0、4.0 g／L 3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6 個(gè)平行樣品，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。從表2 可見，回收率在76.5% ～108.4% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.02% ～8.23% 之間。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取有代表性的總糖含量經(jīng)檢測(cè)符合GB／T 13662-2008 規(guī)定的不同含糖量的4 大類型紹興黃酒元紅酒（干型，總糖含量0 ～10 g／L）、加飯酒（半干型，又稱花雕酒，總糖含量10 ～40 g／L）、善釀酒（半甜型，總糖含量40 ～100 g／L）、香雪酒（甜型，總糖含量＞100 g／L）及QB／T 7545-2005（優(yōu)級(jí)的總糖含量≥10 g／L，一級(jí)的總糖含量不作要求）中規(guī)定的烹飪黃酒各一個(gè)，按所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3，典型的加飯酒樣品譜圖見圖2。

表2 目標(biāo)物在樣品中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs of the analytes spiked in a sample （n＝6）

圖2 含有7 種糖類的加飯酒樣品譜圖Fig.2 Chromatogram of a Jiafan rice wine sample containing seven sugars

由檢測(cè)結(jié)果可見，葡萄糖是各種糖類中含量最高的，其次為潘糖、異麥芽糖和麥芽糖，異麥芽三糖含量較低，果糖在加飯、善釀和香雪酒中檢出，麥芽三糖在個(gè)別樣品中檢出。5 種酒中，烹飪黃酒的含糖量最低，可能是該種酒不直接用于飲用，對(duì)口味要求較低，有可能經(jīng)過(guò)勾兌稀釋；元紅酒發(fā)酵完全，含殘?zhí)巧?，屬于干型酒，含糖種類以葡萄糖和潘糖為主，其余幾種糖含量極低；加飯酒是紹興黃酒中最著名、最普遍的一種，以元紅酒為基礎(chǔ)精制而成，在釀酒過(guò)程中增加糯米和麥麹的量，故各種糖含量較元紅酒高；善釀酒是以貯存1 ～3 年的陳元紅酒代水釀成的雙套酒，即以酒制酒，糖分較高，屬于半甜型酒，其中潘糖含量是4 大類酒中最高的；香雪酒是以糟燒白酒替代水，采用淋飯法釀制的一種雙釀酒，屬于甜型酒，其中的葡萄糖含量是4 大類酒中最高，除潘糖外，其余幾種糖類含量也是4 大類酒中最高。文獻(xiàn)［5］指出，葡萄糖和潘糖含量對(duì)黃酒口味評(píng)分起正面作用，善釀酒潘糖含量高、香雪酒葡萄糖含量高也可以在一定程度上解釋這兩種酒獨(dú)特的口味。

表3 酒類樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of wine samples g／L

2.5 指紋圖譜的建立及分析

對(duì)A、B、C 3 家酒廠每家生產(chǎn)的1 年、3 年、5年、8 年、10 年陳各5 個(gè)批次共75 個(gè)加飯酒樣品進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，建立指紋圖譜并進(jìn)行相似度分析。

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建

3 家酒廠的加飯酒均檢出的共有糖類有葡萄糖、潘糖、異麥芽糖和麥芽糖4 種，檢測(cè)含量見附表1 （http：／／www. chrom-China. com／UserFiles／File／10. 3724SP. J. 1123. 2015. 02053-supplement.pdf）。本文參照文獻(xiàn)［24］所述的方法，以每家所檢樣品4 種糖含量的中位值（見附表1）所組成的圖譜視為該家酒廠加飯酒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

2.5.2 相似度分析

指紋圖譜的相似度計(jì)算首先是將一張指紋圖譜視為一個(gè)n 維向量，組成這個(gè)向量的元素是色譜峰面積（本實(shí)驗(yàn)各物質(zhì)的含量是由峰面積計(jì)算得到的，故計(jì)算時(shí)采用含量替代峰面積），兩張指紋圖譜之間的相似度是對(duì)2 個(gè)n 維向量運(yùn)用公示計(jì)算而得。本文參照文獻(xiàn)［24］的做法采用夾角余弦法計(jì)算相似度，計(jì)算公式如下：

式中：ai為待測(cè)指紋圖譜中第i 個(gè)物質(zhì)峰的含量，bi為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中第i 個(gè)物質(zhì)峰的含量，n 為色譜峰的數(shù)目。計(jì)算過(guò)程可在Excel 軟件中進(jìn)行。

A、B、C 3 家酒廠各25 個(gè)酒樣相對(duì)于A、B、C 標(biāo)準(zhǔn)譜圖的相似度計(jì)算結(jié)果見附表2（http：／／www.chrom-China. com／UserFiles／File／10. 3724SP. J.1123.2015. 02053-supplement. pdf）。由附表2 可見，同一廠家生產(chǎn)的不同批次、不同年份的酒之間相似度較好，含糖量沒(méi)有顯著的差異，但與其余兩家酒廠樣品的標(biāo)準(zhǔn)譜圖相比，相似度明顯變差，如A、B與C 的相似度總體差異較顯著，均小于0.9。這初步說(shuō)明本方法建立的標(biāo)準(zhǔn)譜圖可作為區(qū)分不同廠家紹興加飯酒的依據(jù)之一。

3 結(jié)論

本文建立了高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定黃酒中葡萄糖等7 種單糖和低聚糖的方法，將所建立的方法用于不同糖含量的紹興元紅、加飯、善釀、香雪酒的檢測(cè)。與已有相關(guān)文獻(xiàn)相比，本文利用所建立的方法初步獲得了4 種不同類型黃酒中7 種單糖和低聚糖的含量情況；對(duì)不同廠家不同年份和批次的加飯酒進(jìn)行檢測(cè)并建立指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果顯示指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果可為區(qū)別不同廠家加飯酒提供依據(jù)之一。

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