江虹銳，邵 勇，劉小玲，白 洋，米順利，楊 莉

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣東百維生物科技有限公司，廣東 化州 525100；4.百洋水產(chǎn)集團(tuán)股份有限公司，廣西 南寧 530007）

羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)體外腸道腫瘤的影響

江虹銳1,2，邵 勇2，劉小玲2，白 洋3，米順利4，楊 莉1

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣東百維生物科技有限公司，廣東 化州 525100；4.百洋水產(chǎn)集團(tuán)股份有限公司，廣西 南寧 530007）

目的：體外研究羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo增殖能力的影響，并初步探討其作用機(jī)理。方法：體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tertrazolium bromide，MTT）法檢測(cè)羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響；熒光探針染色法觀察細(xì)胞膜及核的變化；激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達(dá)；比色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性。結(jié)果：羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 mg/mL、作用48 h時(shí)，抑制率達(dá)到55.03%（P＜0.05）；與空白對(duì)照組相比，經(jīng)膠原多肽作用后，LoVo細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞膜出現(xiàn)不完整，細(xì)胞凋亡；且細(xì)胞內(nèi)活性氧水平表達(dá)顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ的活性顯著降低（P＜0.05），但對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的活性無影響。結(jié)論：羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞具有一定的增殖抑制作用，可能與抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ活性，使胞內(nèi)ROS水平增加，破壞細(xì)胞膜形態(tài)有關(guān)。

羅非魚魚皮；膠原多肽；腸道腫瘤；活性氧；線粒體呼吸鏈復(fù)合物

膠原多肽是膠原蛋白或明膠經(jīng)蛋白酶、酸、堿等一定外部條件降解后得到的分子質(zhì)量約為500～30 000 D的產(chǎn)物[1]。膠原多肽的來源較多，主要有豬皮、豬骨、牛皮、魚皮、魚鱗等，加工工藝分為酸水解[2]、堿水解、高溫?zé)峤庖约懊附鈁3]。李少華等[4]以新鮮豬皮為原料，利用木瓜蛋白酶在60 ℃、pH 5的條件下得到膠原多肽水解度為14.91%。戴丹琴等[5]利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按酶活力比3∶1復(fù)合，得到的牛皮膠原蛋白的水解度可達(dá) 32.02%。周亮等[6]研究了以熱水法和酶解法相結(jié)合制備魚鱗膠原多肽，最終水解度達(dá)23.17%。由于不同的降解條件獲得的膠原多肽氨基酸殘基序列組成及空間結(jié)構(gòu)各不相同，使得其具有不同的生理活性，如抗氧化[7]、抗菌[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]等。王茵等[10]研究了經(jīng)復(fù)合酶水解制備出的羅非魚皮膠原多肽降血壓作用，其中高劑量組血壓下降30.37 mmHg，并得出魚皮膠原多肽對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠的降血壓效果顯著，長期飼喂還有穩(wěn)定血壓的功效的結(jié)論。殷娟娟等[11]以酶解脫鈣羅非魚鱗為原料制得膠原多肽，并證明其具有明顯的抗疲勞活性。到目前為止，關(guān)于魚皮膠原多肽抗腫瘤作用的報(bào)道較為少見。

結(jié)腸癌是腸道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌的發(fā)病與環(huán)境因素、生活和飲食習(xí)慣明顯相關(guān)，隨著我國現(xiàn)代化程度和生活水平的提高，國民的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，精細(xì)糧食和高蛋白高脂肪食物的攝入不斷增加，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[12]。因此，研究和開發(fā)預(yù)防腸道腫瘤的功能性食品具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。本研究探討羅非魚魚皮膠原多肽在體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo的增殖影響及作用機(jī)理，為羅非魚下腳料的利用、膠原多肽產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮膠原多肽，廣東百維生物科技有限公司提供，分子質(zhì)量≤6 000 D。其主要制作工藝為：魚皮→脫灰→熱酸處理→酶解→脫色→膜過濾→濃縮→干燥→產(chǎn)品。結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo，購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

F12K培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；小牛血清 四季青有限公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyltertrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、熒光探針Hochest33342、CM-DiI、線粒體超氧化物指示劑MitoSOX-RE 美國Life Technologies公司；線粒體分離試劑盒、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ試劑盒 美國Genemed公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Synergy H4 Hybrid全功能微孔板檢測(cè)儀 美國Biotek公司；A1激光共聚焦顯微鏡 日本Nikon公司；FASscan流式細(xì)胞儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 LoVo細(xì)胞的培養(yǎng)

人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞在含有1%的青鏈霉素和20%新生胎牛血清的F12K培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞長滿瓶底的60%～80%時(shí)，為對(duì)數(shù)生長期。用胰蛋白酶消化2～3 min后，在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞突起、縮回，細(xì)胞間隙增大、近乎縮成圓形時(shí)，加入含有血清的F12K培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打，直至鏡下觀察形成單細(xì)胞懸液，取來血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。按實(shí)驗(yàn)要求調(diào)細(xì)胞濃度。

1.3.2 膠原多肽樣品的配制

稱取一定量羅非魚魚皮膠原多肽，加入F12K培養(yǎng)基溶解配制成終質(zhì)量濃度為1 g/mL的膠原多肽溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前，用F12K培養(yǎng)基分別稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的膠原多肽溶液。以不含羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基為對(duì)照樣品。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制作用分析

將100 μL處于對(duì)數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞按1×104cells/mL接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，分別加入含有10、25、50、100、150、200 mg/mL羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基，作用時(shí)間分別為24、48、72 h。作用后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清。然后每孔加入100 μL DMSO，室溫下低速振蕩5 min，使細(xì)胞中產(chǎn)生的紫色結(jié)晶物（甲臜，formazan）充分溶解。全功能微孔板檢測(cè)儀490 nm波長處測(cè)量各孔的光密度（OD）值。以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對(duì)照。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 細(xì)胞膜、核的形態(tài)觀察

將LoVo細(xì)胞以1×104cells/mL的密度接種至35 mm玻底培養(yǎng)皿中，加入含20%小牛血清的F12K培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去上清。分別加入1 mL含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h，棄去培養(yǎng)液。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，除去未貼壁的細(xì)胞和殘留培養(yǎng)液，加入1 mL含有5 μL CM-DiI和1 μg Hochest 33342的F12K培養(yǎng)基，37 ℃孵育15 min后，PBS清洗兩遍，于激光共聚焦顯微鏡觀察LoVo細(xì)胞膜（λex/λem=553 nm/570 nm）和細(xì)胞核（λex/λem=350 nm/460 nm）形態(tài)。實(shí)驗(yàn)以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對(duì)照。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LoVo細(xì)胞的凋亡

將LoVo細(xì)胞以1×104cells/mL的密度接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入含20%小牛血清的F12K培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)24 h后，棄去上清。分別加入2 mL含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h。胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀。按照AnnexinVFITC/PI試劑盒說明，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，2 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對(duì)照。

1.3.6 細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達(dá)觀察

使用線粒體超氧化物指示劑MitoSOX-RED檢測(cè)細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS。將LoVo細(xì)胞以1×104cells/mL的密度接種至35 mm玻底培養(yǎng)皿中，加入20%小牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去上清。分別加入1 mL/皿含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h，棄去培養(yǎng)液。用PBS除去未貼壁的細(xì)胞和殘留培養(yǎng)液，將各皿中的細(xì)胞孵育在2 mL含有5 μmol/L MitoSOX-RED的HBSS/Ca/Mg溶液中30 min，37 ℃，磷酸鹽緩沖液清洗兩遍，在λex/λem=510 nm/580 nm處使用激光共聚焦顯微鏡觀察LoVo細(xì)胞ROS表達(dá)。實(shí)驗(yàn)以F12K培養(yǎng)基作用組為空白對(duì)照。

1.3.7 細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合酶的水平檢測(cè)

將LoVo細(xì)胞以1×104cells/mL的密度接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入20%新生胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去上清，加入2 mL含100 mg/mL的羅非魚魚皮膠原多肽的F12K培養(yǎng)基作用48 h，棄去培養(yǎng)液。胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞沉淀。使用線粒體分離試劑盒提取LoVo細(xì)胞的線粒體，于－70 ℃保存。使用線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ試劑盒檢測(cè)羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞作用后，細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-輔酶Q還原酶，reduced nicotinamide adenine dinucleotide-coenzyme Q reductase，NADH-Q reductase）和Ⅲ（輔酶Q-細(xì)胞色素c還原酶, reduced coenzyme Q-cytochrome c reductase，CoQH2-Cyt c reductase）的水平。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及作圖采用SPSS 13.0、Sigma Plot11.0軟件，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞的增殖影響

由圖1可知，羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞的抑制率隨膠原多肽質(zhì)量濃度的增加而增大，但隨著作用時(shí)間的延長，其抑制率發(fā)生變化。作用24 h，膠原多肽達(dá)到最大抑制率的質(zhì)量濃度為150 mg/mL，抑制率為（37.00±0.02）%；作用48 h，膠原多肽達(dá)到最大抑制率的質(zhì)量濃度為200 mg/mL（抑制率（59.69±0.02）%）；作用72 h，膠原多肽達(dá)到最大抑制率的質(zhì)量濃度為150 mg/mL，（抑制率為（46.15±0.03）%）。隨著作用時(shí)間的延長，相同作用質(zhì)量濃度達(dá)到細(xì)胞最佳抑制率的作用時(shí)間為48 h。100 mg/mL與150 mg/mL的膠原多肽在不同作用時(shí)間的抑制率較為接近。從抑制效果（抑制率超過50%）和適用性考慮，選擇膠原多肽質(zhì)量濃度為100 mg/mL、作用時(shí)間48 h（抑制率55.03%，P＜0.05）來研究膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞增殖影響及作用機(jī)理。

圖1 膠原多肽在不同質(zhì)量濃度和時(shí)間對(duì)LoVo細(xì)胞的作用Fig.1 Effects of collagen peptides on the growth inhibition of LoVo cells at different concentrations and treatment times

2.2 羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞核、膜影響的形態(tài)學(xué)觀察

相對(duì)于空白對(duì)照組，經(jīng)100 mg/mL、48 h膠原多肽作用后LoVo細(xì)胞核（藍(lán)色）出現(xiàn)核濃縮（圖2A）；細(xì)胞膜（紅色）著色不均勻，大多數(shù)細(xì)胞膜形態(tài)不完整（圖2B）。從結(jié)果中推測(cè)，羅非魚魚皮膠原多肽作用后腸道腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮，且細(xì)胞膜受到破壞。

圖2 膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞膜和核形態(tài)的影響（160×）Fig.2 Membrane and nuclear morphology of LoVo cells treated by collagen peptides (160×)

2.3 羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞的凋亡作用

圖3為LoVo細(xì)胞經(jīng)FITC-AnnexinV和PI標(biāo)記后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中Q1域表示許可范圍內(nèi)的檢測(cè)誤差，Q2域表示壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞，Q3域表示正常細(xì)胞，Q4域表示早期凋亡細(xì)胞。除了細(xì)胞自身的發(fā)生程序性死亡外，與空白對(duì)照組（Q4=7.4%）相比，膠原多肽作用組對(duì)LoVo細(xì)胞有促凋亡作用（Q4=12.6%）。膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞增殖活性的抑制可能與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。

圖3 膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用Fig.3 Effect of collagen peptides on the induction of apoptosis in LoVo cells

2.4 羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞ROS水平的影響

圖4 膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞中ROS表達(dá)的影響（160×）Fig.4 Expression of ROS in LoVo cells treated by collagen peptides (160×)

如圖4所示，鮮艷的深紅色為ROS，ROS大多數(shù)分布在細(xì)胞核，一部分表達(dá)在細(xì)胞間。空白對(duì)照組可見完整的細(xì)胞輪廓；與空白對(duì)照組相比，經(jīng)100 mg/mL、48 h羅非魚魚皮膠原多肽作用的LoVo細(xì)胞數(shù)量減少，但ROS表達(dá)量顯著增加。以視野中每104個(gè)LoVo細(xì)胞完全發(fā)熒光為100%計(jì)算LoVo細(xì)胞ROS相對(duì)熒光密度?？瞻讓?duì)照組每104個(gè)LoVo細(xì)胞ROS相對(duì)熒光密度為（10.39±0.04）%；膠原多肽作用組相對(duì)熒光密度為（18.24±1.02）%（P＜0.05）。此外，通過ROS在LoVo細(xì)胞中的分布位置觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)膠原多肽作用后的LoVo細(xì)胞內(nèi)ROS幾乎完全覆蓋了細(xì)胞。該結(jié)果說明羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平造成活性氧損傷引起的。

2.5 羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的影響

如圖5A所示，與空白對(duì)照組中線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的活力（（6.85±0.92）μmol NADH/（min·mg））相比，羅非魚魚皮膠原多肽作用組對(duì)LoVo細(xì)胞的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的活性有輕微的增強(qiáng)作用（（7.22±0.33） μmol NADH/（min·mg）），但差異不顯著，無法判斷羅非魚魚皮膠原多肽是否對(duì)LoVo細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ有影響。如圖5B所示，與空白對(duì)照組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ的活力（19.02±2.90）μmol CoQH2/（min·mg）相比，羅非魚魚皮膠原多肽作用組顯著抑制了復(fù)合物Ⅲ的活力（（10.97±0.64） μmol CoQH2/（min·mg），P＜0.05）。從該結(jié)果中推測(cè)，羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞增殖抑制可能與其抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅲ活性有關(guān)。

圖5 膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的影響Fig.5 Effect of collagen peptides on the activity of mitochondrial complexes in LoVo cells

3 討 論

羅非魚是我國主要的淡水經(jīng)濟(jì)魚種，隨著我國水產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展，特別是對(duì)魚片加工，具有大量的魚皮、魚骨等下腳料資源。利用魚皮、魚骨等副產(chǎn)品提取膠原蛋白、膠原多肽等產(chǎn)品，在食品、化妝品和保健品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，大大提高了水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的產(chǎn)品附加值。因此，具有一定生物活性的膠原多肽對(duì)于功能性食品的開發(fā)可提供一定理論基礎(chǔ)。

膠原蛋白經(jīng)水解后可產(chǎn)生分子質(zhì)量大小、氨基酸組成、空間結(jié)構(gòu)不同的肽段，這些水解物具有多種生物活性，如抗高血壓、抗菌、抗炎癥和抗氧化等。在抗腫瘤方面，Monboisse等[13]研究發(fā)現(xiàn)從膠原蛋白中得到的一些分解產(chǎn)物對(duì)多種荷瘤鼠模型的腫瘤生長有很好的抑制作用；Popov等[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶水解后的海參膠原蛋白能夠延長腹水瘤小鼠的存活期；Pasco等[15]發(fā)現(xiàn)Ⅳ型膠原經(jīng)水解后的部分肽段可控制黑色素瘤的浸潤，其作用機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞金屬蛋白酶（metalloprotinases，MMP）的表達(dá)和活性有關(guān)。膠原蛋白的來源多來自于豬皮、豬骨、牛皮、魚皮、魚鱗、鼠尾等，關(guān)于魚皮膠原蛋白及其水解產(chǎn)物在抗腫瘤方面的生物活性的報(bào)道較少。本研究中，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，與對(duì)照組相比，羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)腸道腫瘤LoVo細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用；通過激光共聚焦掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠原多肽作用后，LoVo細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮，屬于凋亡細(xì)胞的典型特征。細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）遷移至細(xì)胞外側(cè)，可以利用細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜成分的改變來檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況[16]。AnnexinV-PI染色法既可檢測(cè)腫瘤的早期凋亡，又可區(qū)分凋亡與死亡細(xì)胞，本研究通過流式細(xì)胞儀、AnnexinV-PI染色法進(jìn)一步檢測(cè)膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，羅非魚魚皮膠原多肽促進(jìn)了LoVo細(xì)胞的早期凋亡。

細(xì)胞凋亡信號(hào)通路主要有兩種：一種是死亡受體途徑（外源性途徑），另一種是線粒體途徑（內(nèi)源性途徑）。其中，凋亡的線粒體途徑包括線粒體膜通透化、細(xì)胞色素c的釋放、電子傳遞的改變、細(xì)胞ROS的改變和相關(guān)信號(hào)蛋白和信號(hào)因子的表達(dá)變化[17]，繼而導(dǎo)致細(xì)胞核濃縮、細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)PS外翻、細(xì)胞膜泡狀化。來源于線粒體的ROS水平對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段對(duì)腫瘤的存活和凋亡有重要影響[18]。腫瘤細(xì)胞中ROS的表達(dá)高于正常細(xì)胞[19]，且腫瘤細(xì)胞更容易受到氧化應(yīng)激的傷害。低劑量的ROS會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生長[20]，而增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。有研究表明羅非魚膠原蛋白經(jīng)過胃腸道消化酶水解后，其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力增加，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性[22]。目前，膠原多肽的抗氧化活性大多基于體外的化學(xué)分析檢測(cè)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)的抗氧化作用，還未見報(bào)道。本研究的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)過羅非魚皮膠原多肽作用后的LoVo細(xì)胞內(nèi)ROS水平表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），其對(duì)LoVo細(xì)胞的凋亡作用可能與ROS增加有關(guān)。為了尋找膠原多肽促進(jìn)LoVo細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高的原因，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性。在腫瘤的生長過程中，常伴隨著細(xì)胞線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變的發(fā)生。而mtDNA突變會(huì)導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ或Ⅲ缺乏，使呼吸鏈中途的“電子漏”將氧直接接受單電子生成ROS[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅非魚魚皮膠原多肽顯著的抑制了復(fù)合物Ⅲ的活性，但對(duì)復(fù)合物Ⅰ的活性作用效果不明顯。結(jié)果提示，羅非魚魚皮膠原多肽誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞ROS表達(dá)增加的原因可能與抑制線粒體復(fù)合物Ⅲ活性有關(guān)。此外，由于細(xì)胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等生物膜均由磷脂雙分子層及膜蛋白構(gòu)成，對(duì)ROS敏感，大量的ROS可損害細(xì)胞膜脂質(zhì)，線粒體內(nèi)膜[24]。本研究中，羅非魚魚皮膠原多肽經(jīng)作用后的LoVo細(xì)胞內(nèi)ROS的水平顯著增強(qiáng)（P＜0.05），可能是造成細(xì)胞膜著色不均一、結(jié)構(gòu)破壞的原因。羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡作用機(jī)制、以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制是否與其抗氧化活性有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)初步探究了羅非魚膠原多肽對(duì)腸道腫瘤的抑制機(jī)制。結(jié)果表明，羅非魚魚皮膠原多肽對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的增殖具有抑制能力，從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核濃縮、細(xì)胞膜受到破壞；從流式細(xì)胞術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，膠原多肽作用后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有促凋亡作用；此外，經(jīng)膠原多肽作用后，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），這可能與其抑制細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ活性有關(guān)。膠原多肽對(duì)LoVo細(xì)胞抑制作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Collagen Peptides from Tilapia Skin on Colon Carcinoma in Vitro

JIANG Hongrui1,2, SHAO Yong2, LIU Xiaoling2, BAI Yang3, MI Shunli4, YANG Li1
(1. Public Health of Guangxi Medicine University, Nanning 530021, China; 2. College of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 3. Guangdong Baiwei Biological Technology Co. Ltd., Huazhou 525100, China; 4. Baiyang Aquatic Group, Inc., Nanning 530007, China)

Objective: To investigate the effects of collagen peptides from tilapia skin on the proliferation ability of human colon carcinoma cell line LoVo in vitro and its possible mechanism. Methods: The inhibitory effects of collagen peptides from tilapia on the proliferation of LoVo cells were observed by MTT assay. Fluorescent staining method was used to analyze the effect on cell membrane and nucleus. Laser confocal microscopy was used to examine reactive oxygen species (ROS) expression in LoVo cells. The activities of mitochondrial respiration chain complex I and III were analyzed by colorimetry. Results: Collagen peptides from tilapia skin showed certain inhibitory effect on the proliferation of LoVo cells. After being treated by 100 mg/mL of collagen peptides for 48 h, the growth inhibitory effect rate reached 55.03% (P ＜ 0.05). Compared with the control group, the nucleus of LoVo cells was shrunk and cell membrane was destructed after being treated by collagen peptides. Meanwhile, the ROS level was significantly increased (P ＜ 0.05). Collagen peptides significantly inhibited the activity of complex III. Conclusion: Collagen peptides from tilapia skin have inhibitory effects on the proliferation of human colon carcinoma cells, which is probably associated with the inhibited activity of mitochondrial respiration chain complex III in LoVo cells, promoting ROS expression and destructing the cell membrane in LoVo cells.

tilapia skin; collagen peptides; colon carcinoma; reactive oxygen species (ROS); mitochondrial respiratory chain complex

TS254.6

A

1002-6630（2015）21-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201521037

2015-01-06

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201349）；茂名市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012A01005）；

廣西醫(yī)科大學(xué)博士后科研資助項(xiàng)目（20121018）

江虹銳（1984－），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：jianghr1984@163.com