鞠秀云，姜素平，劉金娟，袁 博，蔣繼宏

（江蘇師范大學(xué) 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116）

黑大蒜和鮮大蒜中可溶性蛋白成分的比較研究

鞠秀云，姜素平，劉金娟，袁 博，蔣繼宏*

（江蘇師范大學(xué) 江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116）

為探究黑大蒜和鮮大蒜中可溶性蛋白成分的差異，采用研磨浸提、硫酸銨沉淀、凝膠柱層析的方法，獲得黑大蒜和鮮大蒜可溶性蛋白；采用阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）法檢測(cè)其體外抗腫瘤活性，采用牛津杯法檢測(cè)其抗菌活性，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析其可溶性蛋白成分的差異。結(jié)果表明：從黑大蒜和鮮大蒜中提取的可溶性蛋白均具有抗人肝癌細(xì)胞株HepG2的活性，鮮大蒜中可溶性蛋白的抗腫瘤活性高于黑大蒜中可溶性蛋白的抗腫瘤活性，且具有耐熱性；鮮大蒜中可溶性蛋白還具有抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌的活性，其分子質(zhì)量在10～55 kD之間；黑大蒜中的可溶性蛋白不具有抗菌活性，其分子質(zhì)量在10 kD左右。黑大蒜與鮮大蒜的可溶性蛋白在種類上差異較大，在抗人肝癌細(xì)胞株HepG2、抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌的功能上差異顯著。

大蒜；可溶性蛋白；抗腫瘤；抗細(xì)菌活性

大蒜（Allium sativum L.）為百合科蔥屬多年生草本植物的地下鱗莖，具有抗菌消炎[1-2]、增強(qiáng)免疫力[3]、護(hù)肝[4]、防癌[5]、抗癌[6-7]、延緩衰老[8]、降低膽固醇水平[9]和降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[10-11]等多種功效。對(duì)于大蒜這些藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)目前研究較多的是含硫有機(jī)化合物[12-13]（主要包括蒜氨酸、大蒜素等）和大蒜多糖[14-15]。

黑大蒜是以新鮮的生大蒜為原料，經(jīng)過(guò)清洗、一定條件下較長(zhǎng)時(shí)間的美拉德反應(yīng)、干燥等過(guò)程加工而成的一種新型大蒜制品。它去除了大蒜的異味，帶有甜味、口感較好。研究表明黑大蒜中多種營(yíng)養(yǎng)成分（如糖分、多酚、氨基酸）的含量增加了1 倍以上[16-17]，而作為美味成分的氨基酸、果糖的含量則比鮮大蒜增加了2.5 倍[18-19]；陳瀏丹[20]還對(duì)黑大蒜提取物對(duì)固有免疫細(xì)胞抗腫瘤活性的影響進(jìn)行了相關(guān)研究。但目前對(duì)于大蒜中蛋白質(zhì)的研究卻較少，僅魏雪盈等[21]從鮮大蒜中分離到兩種抗真菌活性蛋白，另有一些研究者采用凱氏定氮法測(cè)定了黑蒜總蛋白質(zhì)的含量[22]。本實(shí)驗(yàn)采用提取法將黑大蒜和鮮大蒜中的可溶性蛋白提取后進(jìn)行檢測(cè)，比較其含量和相關(guān)活性差異，為人們正確理解黑大蒜和鮮大蒜的保健功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮大蒜 市售；黑大蒜 徐州綠之野生物食品有限公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

人肝癌細(xì)胞株HepG2，江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、Tris、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Sigma公司；Bio-Gel P4 Gel 美國(guó)Bio-Rad公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

D37520型Heraeus Biofuge臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Kendrc公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶標(biāo)儀 美國(guó)分子儀器公司；AKTA purifier快速純化系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、實(shí)時(shí)電導(dǎo)監(jiān)測(cè)器、樣品自動(dòng)收集器和色譜工作站） 美國(guó)GE醫(yī)療集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 可溶性蛋白提取

硫酸銨沉淀：將樣品剪碎，加少量10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），充分研磨后，再加入兩倍體積磷酸鹽緩沖液，4 ℃條件下浸泡10 h以上。將浸提液4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，加入硫酸銨固體到80%飽和度，4 ℃靜置過(guò)夜，12 000 r/min離心30 min，收集沉淀，溶于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），得到可溶性蛋白粗提液，－20 ℃保存。

凝膠柱層析脫鹽脫色：取上述可溶性蛋白粗提液，上樣到平衡好的Bio-Gel P4 Gel柱（1.5 cm×27 cm，45～90 μm），用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)280 nm，按峰收集洗脫液。

1.3.2 可溶性蛋白含量測(cè)定

采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3.3 抗腫瘤細(xì)胞活性測(cè)定

采用Alamar Blue法檢測(cè)樣品可溶性蛋白的體外抗腫瘤活性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成2×105個(gè)/mL的懸液，用微量加樣器接種于96 孔板中，每孔100 μL，邊緣孔中不加細(xì)胞，僅加完全培養(yǎng)基作為無(wú)細(xì)胞空白組，（37.0±0.5） ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。每孔加一定量樣品，再用完全培養(yǎng)基補(bǔ)加至100 μL；同時(shí)留數(shù)孔不加樣品，補(bǔ)加完全培養(yǎng)基100 μL，作為空白對(duì)照組。相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔用200 μL基本培養(yǎng)基洗一次，傾去，每孔再加入基本培養(yǎng)基180 μL、Alamar Blue 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于激發(fā)光波長(zhǎng)530 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)590 nm處檢測(cè)并記錄熒光強(qiáng)度，按下式計(jì)算樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率。

1.3.4 抗細(xì)菌活性測(cè)定

采用牛津杯法（管碟法）測(cè)定樣品的抑菌活性：將滅好菌的LB培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約15 mL，水平放置至其完全凝固，取0.2 mL制備好的菌懸液（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）在平板上均勻涂布，涂布后以平板無(wú)可見水滴為準(zhǔn)。用鑷子將無(wú)菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，每皿均勻地放置3 支牛津杯。取樣品液0.20 mL加至牛津杯中，每一個(gè)樣品重復(fù)3 次，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 分子質(zhì)量范圍測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定黑大蒜和鮮大蒜中可溶性蛋白的分子質(zhì)量，其中分離膠中丙烯酰胺總含量為15%；濃縮膠中丙烯酰胺總含量為5%，其中交聯(lián)的丙烯酰胺占2.6%，考馬斯亮藍(lán)法染色[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白提取結(jié)果

鮮大蒜和黑大蒜經(jīng)研磨浸提、硫酸銨沉淀、Bio-Gel P4 Gel柱層析后，獲得可溶性蛋白，采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定每步提取后的可溶性蛋白含量，計(jì)算純度和回收率，具體結(jié)果見表1。

表1 鮮大蒜和黑大蒜中可溶性蛋白提取結(jié)果Table 1 Isolation of soluble proteins from black garlic and fresh garlic

分析表1的提取結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑大蒜中提取到的可溶性蛋白比鮮大蒜中略低；而有些文獻(xiàn)報(bào)道，黑大蒜中的蛋白質(zhì)含量為鮮大蒜中的2 倍。造成這種差異的原因是獲取蛋白的方法不同，文獻(xiàn)中普遍采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，而非直接測(cè)定可溶性蛋白含量。

2.2 可溶性蛋白的抗腫瘤細(xì)胞活性

將鮮大蒜和黑大蒜的研磨浸提液和Bio-Gel P4 Gel柱層析后的收集液用水配制成可溶性蛋白含量為1 mg/mL的樣品溶液，同時(shí)取一定量上述溶液進(jìn)行95 ℃、5 min的加熱處理，將制備好的樣品再用細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行1∶10、1∶20、1∶40稀釋，測(cè)定其抗腫瘤細(xì)胞活性，具體結(jié)果見表2。

表2 鮮大蒜和黑大蒜中可溶性蛋白抗腫瘤細(xì)胞活性比較Table 2 Comparison of antitumor activity of soluble proteins from black garlic and fresh garlic

分析表2數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL的各樣品1∶10稀釋后，均表現(xiàn)出很高的抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的活性，這說(shuō)明鮮大蒜和黑大蒜的可溶性蛋白均具有抗腫瘤細(xì)胞的活性；但隨著溶液稀釋倍數(shù)的增大，各樣品表現(xiàn)出了不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞活性，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1∶40時(shí)，鮮大蒜柱層析液仍表現(xiàn)出較高的抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的活性（加熱前樣品的抑制率為84.1%，加熱后樣品的抑制率為81.7%），經(jīng)相同條件處理的黑大蒜提取液則沒有活性。由此可以推斷，鮮大蒜中的可溶性蛋白抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的活性高于黑大蒜，而且具有耐熱性。

從表2的數(shù)據(jù)中還可以發(fā)現(xiàn)，樣品稀釋倍數(shù)增加后，加熱后的鮮大蒜浸提液抗腫瘤細(xì)胞活性快速下降（1∶40稀釋時(shí)對(duì)HepG2的抑制率為－0.4%），而較純的蛋白樣品，即鮮大蒜柱層析液加熱后活性降低較慢，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是浸提液中的其他成分在加熱條件下對(duì)可溶性蛋白有破壞作用，這與黑大蒜的可溶性蛋白抗腫瘤活性低于鮮大蒜的結(jié)果相一致。黑大蒜是由鮮大蒜在高濕高溫的條件下生產(chǎn)得到的[24]，在此過(guò)程中部分具有抗腫瘤活性的可溶性蛋白被降解，從而導(dǎo)致其抗腫瘤活性低于鮮大蒜。

2.3 可溶性蛋白的抗細(xì)菌活性

將從鮮大蒜和黑大蒜中提取的可溶性蛋白配制成1 mg/mL的溶液，同時(shí)取一定量上述溶液進(jìn)行95 ℃、5 min的加熱處理，將上述樣品分別進(jìn)行抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1～3所示。

圖1 鮮大蒜中可溶性蛋白對(duì)大腸桿菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of soluble proteins from fresh garlic on Escherichia coli

圖2 鮮大蒜中可溶性蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of soluble proteins from fresh garlic on Staphylococcus aureus

由圖1、2可知，鮮大蒜的可溶性蛋白對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，但加熱后抑菌活性基本消失，這說(shuō)明鮮大蒜中具有抗菌活性的可溶性蛋白不具有耐熱性。由圖3可知，黑大蒜的可溶性蛋白沒有抑菌活性。

圖3 黑大蒜中可溶性蛋白對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of soluble proteins from black garlic on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.4 可溶性蛋白分子質(zhì)量范圍

將經(jīng)過(guò)Bio-Gel P4 Gel柱層析獲得的可溶性蛋白配成2 mg/mL的溶液，取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示鮮大蒜的可溶性蛋白分子質(zhì)量主要在10～55 kD范圍內(nèi)（圖4中2號(hào)條帶），而黑大蒜的可溶性蛋白分子質(zhì)量主要在10 kD左右（圖4中3號(hào)條帶）。這說(shuō)明鮮大蒜經(jīng)高溫高濕的等工藝生產(chǎn)得到黑大蒜，在此過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，使得黑大蒜中可溶性蛋白分子質(zhì)量明顯低于鮮大蒜。

圖4 鮮大蒜和黑大蒜可溶性蛋白的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE of soluble proteins from black garlic and fresh garlic

3 討 論

大蒜是著名的藥食兩用植物，具有多種生物活性[25]。隨著人們對(duì)自身健康的重視以及對(duì)天然藥食的青睞，已圍繞大蒜開發(fā)出多種保健食品，如大蒜粉、大蒜油、大蒜飲料、脫水大蒜等[26-27]，其中黑大蒜因去除了原來(lái)的辣味且略帶果香味、營(yíng)養(yǎng)成分豐富而備受人們的喜愛。有關(guān)鮮大蒜和黑大蒜營(yíng)養(yǎng)成分的研究也受到了人們的重視。張?chǎng)蔚萚28]比較了黑大蒜和鮮大蒜提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)黑大蒜提取物較鮮大蒜提取物有更強(qiáng)的自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活性和促NO、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-17、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌的作用；二者對(duì)IL-4的分泌水平無(wú)影響。王衛(wèi)東等[29]對(duì)黑大蒜在生產(chǎn)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)成分變化和抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)黑大蒜中的水分含量相較于鮮大蒜有所下降；還原糖、總酸、總酚含量相較于鮮大蒜有所上升，黑大蒜的還原能力、羥自由基清除率分別是鮮大蒜的10 倍和3 倍。由此得出黑大蒜抗氧化能力的增強(qiáng)在一定程度上與其含有的總酚和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量增加有關(guān)的結(jié)論。

在對(duì)于蛋白質(zhì)含量的變化研究中，研究者普遍采用凱氏定氮法測(cè)定，得出黑大蒜蛋白含量比鮮大蒜增加了1 倍左右的結(jié)論。凱氏定氮法測(cè)定的是樣品中總氮元素的含量，是間接測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量的一種方法。鮮大蒜經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的美拉德反應(yīng)后，一些蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，可能會(huì)使原本的蛋白氮變成非蛋白氮。因此，僅通過(guò)比較黑大蒜和鮮大蒜中的總蛋白含量來(lái)評(píng)估兩者的優(yōu)劣不夠全面和科學(xué)。本研究將樣品中的可溶性蛋白提取后進(jìn)行測(cè)定，比較其含量和相關(guān)活性的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑大蒜中的可溶性蛋白分子質(zhì)量遠(yuǎn)低于鮮大蒜，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)后，高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)降解為低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，甚至是氨基酸。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的降低有利于人體腸道的消化吸收，對(duì)于胃腸道功能較弱的人，食用黑大蒜更有利。然而隨著蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的改變，其功效也發(fā)生了改變，黑大蒜中可溶性蛋白的體外抗腫瘤活性、抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性有所下降。本研究結(jié)果為人們理解黑大蒜和鮮大蒜的保健功能和正確食用兩類食品提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Comparison of Soluble Protein Components of Black Garlic and Fresh Garlic

JU Xiuyun, JIANG Suping, LIU Jinjuan, YUAN Bo, JIANG Jihong*
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China)

The aim of this study was to compare the difference of soluble protein components isolated from black garlic and fresh garlic. Soluble proteins were isolated from garlic by serial extraction methods including grinding, ammonium sulfate precipitation and gel filtration. Then, the antitumor activities of the extracts were determined in vitro using alamar blue method; the antibacterial activities were detected by oxford cup assay; and the differences of soluble protein components were further compared using SDS-PAGE. The results showed that the soluble protein components from both fresh garlic and black garlic were able to inhibit the growth of HepG2 cells. The soluble protein components from fresh garlic had stronger antitumor activity than those from fresh garlic and had heat resistance property. The soluble protein components from fresh garlic could inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus. SDS-PAGE results showed that the molecular weight of soluble proteins in fresh garlic was in the range from 10 to 55 kD, and was about 10 kD for black garlic. This study indicated that there were significant differences in soluble protein species and functions between black garlic and fresh garlic.

garlic; soluble protein; antitumor; antibacterial activity

TS255.1

A

1002-6630（2015）21-0090-05

10.7506/spkx1002-6630-201521018

2014-12-31

徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（XF13C036）

鞠秀云（1973—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：juxiuyun@jsnu.edu.cn

*通信作者：蔣繼宏（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参锷锛夹g(shù)。E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn