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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

EPO聯(lián)合BMSCs治療對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)的影響

謝中，羊明智*，胡文凱，彭立軍，劉騫

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)與促紅細(xì)胞生成素(EPO)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)的影響。方法將80只SD大鼠隨機(jī)分成手術(shù)對(duì)照組(n=15)、EPO治療組(n=15)、BMSCs治療組(n=25)和BMSCs聯(lián)合EPO治療組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組、n=25)。造模后第7天EPO組大鼠經(jīng)腹腔注射EPO,BMSCs組、聯(lián)合組大鼠則經(jīng)損傷脊髓局部注射BMSCs和局部注射BMSCs的同時(shí)加用EPO腹腔注射。應(yīng)用雙標(biāo)免疫熒光法檢測(cè)5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記的神經(jīng)元中絲蛋白(NF-M)的表達(dá)情況；取脊髓組織作HE染色觀察脊髓損傷及恢復(fù)程度；用(BBB)法檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。結(jié)果聯(lián)合組較BMSCs移植治療組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織水腫顯著減輕。移植的BMSCs在宿主脊髓中存活，聯(lián)合組中NF-M陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均比其余組多(P<0.05)。聯(lián)合組在不同的時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能BBB評(píng)分都較BMSCs組及EPO組高。結(jié)論BMSCs移植與EPO腹腔注射是治療大鼠脊髓損傷的有效方法；BMSCs與EPO聯(lián)合應(yīng)用對(duì)脊髓損傷修復(fù)具有協(xié)同作用。

促紅細(xì)胞生成素； 間質(zhì)干細(xì)胞； 脊髓損傷； 移植； BBB評(píng)分； 神經(jīng)功能恢復(fù)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類嚴(yán)重創(chuàng)傷，其高致殘率和死亡率成為脊柱外科工作者急需解決的難題。近年來(lái)隨著神經(jīng)生物學(xué)的飛速發(fā)展，細(xì)胞移植成為治療脊髓損傷最有希望的方法之一[1]。從目前的資料來(lái)看，BMSCs(Bone mesenchymal stem cell，BMSCs)具有多向分化潛能[2]、極大的可塑性[3]、強(qiáng)大的增殖能力[4]、高度的遷移性等特點(diǎn)[5]成為理想的細(xì)胞移植治療和基因治療的首選細(xì)胞。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種多功能神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和保護(hù)因子，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和保護(hù)神經(jīng)的作用，是一個(gè)新的具有廣闊發(fā)展前景的神經(jīng)保護(hù)劑[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Allen’s大鼠脊髓損傷模型局部進(jìn)行BMSCs移植的同時(shí)加用EPO腹腔注射，研究局部移植BMSCs在脊髓損傷修復(fù)中的作用，并探討EPO與BMSCs聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)的影響以及EPO在大鼠體內(nèi)是否可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，為治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑及儀器80只健康SD青年大鼠，清潔級(jí)，體重220±10 g，均購(gòu)于湖南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。重組促紅細(xì)胞生成素，2000 IU/支，由沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)(批號(hào)：1001032)。DAB顯色劑(武漢博士德生物有限公司)，BrdU(廣州市銳博生物有限公司)，鼠抗神經(jīng)元中絲蛋白單抗(美國(guó)Neomaekers公司)，小鼠抗BrdU抗體(武漢博士德生物有限公司),蘇木素伊紅染液(重慶東方制藥廠),YPS-2000系列彩色病理圖文分析(德國(guó)萊卡公司),ZMN-6802病理組織溶烘儀(常州市華利電子公司),LeicaRM2016切片機(jī)(上海來(lái)卡儀器),YB-6D生物組織石蠟包買(mǎi)機(jī)(湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)。

1.2分組及給藥方法80只SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、EPO治療組、BMSCs治療組、BMSCs聯(lián)合EPO治療組。對(duì)照組大鼠于造模后第7天在損傷脊髓局部注射5 μL BMSCs培養(yǎng)液；EPO治療組于造模后第7天按2 000 lU/kg腹腔注射EPO進(jìn)行治療；BMSCs治療組于造模后第7天在損傷脊髓局部注射5 μL BMSCs懸液進(jìn)行治療；BMSCs聯(lián)合EPO治療組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)于造模后第7天在損傷脊髓局部注入5 μL BMSCs懸液，同時(shí)按2 000 lU/kg腹腔注射EPO治療。對(duì)照組、EPO組各15只大鼠，BMSCs組、聯(lián)合組各25只。

1.3 BMSCs的移植[7]大鼠脊髓損傷模型建立后第7天，把培養(yǎng)液加入5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記過(guò)的第3代BMSCs(由中南大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)，將細(xì)胞濃度調(diào)至5×104～1×105個(gè)/μL的范圍內(nèi)待用。用微量注射器將5 μL經(jīng)BrdU標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞懸液緩慢注入BMSCs組及聯(lián)合組大鼠損傷脊髓臨近區(qū)域的灰白質(zhì)交界處。

1.4行為學(xué)檢測(cè)移植治療后1天,7天，14天，21天，28天，各組取10只大鼠置于寬闊的地板上，在雙盲法的前提下觀察其雙側(cè)后肢各關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的范圍和數(shù)量，根據(jù)雙下肢步態(tài)是否協(xié)調(diào)以及運(yùn)動(dòng)程度進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(BBB)[8]，并作記錄，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的方差分析。

1.5動(dòng)物取材及陽(yáng)性細(xì)胞的判定和計(jì)數(shù)對(duì)照組、EPO組21天時(shí)隨機(jī)選5只大鼠取標(biāo)本做常規(guī)HE染色及神經(jīng)元中絲蛋白(neurofilament-M,NF-M)免疫組化，光鏡下觀察組織病理學(xué)的變化。BMSCs組及聯(lián)合組3天、7天、21天時(shí)隨機(jī)選5只大鼠取標(biāo)本行Brdu+NF-M雙標(biāo)免疫熒光，另取21天時(shí)標(biāo)本做常規(guī)HE染色及NF-M免疫組化。在400倍光鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)視野中Brdu和NF-M雙染，NF-M單染陽(yáng)性細(xì)胞，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1大鼠脊髓損傷行為學(xué)檢測(cè)(BBB評(píng)分) 治療后第7天、14天、21天和28天時(shí)，EPO組、BMSCs組及聯(lián)合組的BBB評(píng)分比對(duì)照組明顯升高，且聯(lián)合組的神經(jīng)功能改善明顯高于EPO組和BMSCs組，見(jiàn)表1。

表1各組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分表(分)

組別第1天第7天第14天第21天第28天對(duì)照組3.05±0.124.57±0.236.68±0.288.12±0.3610.12±0.35EPO組3.35±0.146.45±0.28ab8.67±0.34ab12.42±0.52ab14.83±0.54abBMSCs組3.38±0.246.56±0.32ab8.92±0.24ab13.16±0.44ab15.14±0.67ab聯(lián)合組3.56±0.199.14±0.38a12.16±0.43a15.71±0.65a17.68±0.86a

與對(duì)照組比較，a:P﹤0.05；與聯(lián)合組比較，b：P<0.05

2.2脊髓組織HE染色檢查結(jié)果移植后21天，手術(shù)對(duì)照組(圖1A)有較多空腔，白質(zhì)中有許多微囊，神經(jīng)纖維及細(xì)胞壞死，在挫傷處附近形成較多空泡；聯(lián)合組(圖1B)脊髓組織在高倍鏡下觀察可見(jiàn)脊髓組織中無(wú)明顯空腔，空泡小而少，色澤較亮，膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，脊髓有許多增生組織填充，損傷脊髓周?chē)芤?jiàn)到較完整的神經(jīng)細(xì)胞；EPO組(圖1C)和BMSCs組(圖1D)神經(jīng)纖維及細(xì)胞變性、壞死的程度和數(shù)量較重。

圖1 治療后第21天各組大鼠脊髓組織恢復(fù)情況(HE染色×200) A：對(duì)照組；B：EPO組；C：BMSCs組；D：聯(lián)合治療組

2.3 Brdu與NF-M雙標(biāo)免疫熒光染色結(jié)果聯(lián)合組(圖2A)與BMSCs組(圖2B)脊髓組織內(nèi)均可見(jiàn)到BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞存在，聯(lián)合組中BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比BMSCs組多；從移植后的第7天可以檢測(cè)到BrdU和NF-M雙標(biāo)染色陽(yáng)性的細(xì)胞。聯(lián)合組(圖2C)中BrdU和NF-M雙標(biāo)染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)較BMSCs組(圖2D)多(P<0.05)。

圖2 BrdU和NF-M雙標(biāo)染色陽(yáng)性的細(xì)胞分布(免疫熒光×400) A：聯(lián)合治療組治療第3天；B：BMSCs組治療第3天；C：聯(lián)合治療組治療第7天；D：BMSCs組治療第7天

2.4 NF-M免疫組化結(jié)果對(duì)照組(圖3A)可見(jiàn)少量免疫反應(yīng)陽(yáng)性的神經(jīng)纖維，較小，也可見(jiàn)少量膠質(zhì)細(xì)胞活躍增生，突起細(xì)而短；EPO組(圖3B)與BMSCs組(圖3D)可見(jiàn)較多的染色陽(yáng)性的神經(jīng)纖維，少量長(zhǎng)入瘢痕內(nèi)，膠質(zhì)細(xì)胞增生較對(duì)照組多；而EPO加BMSCs聯(lián)合應(yīng)用組(圖3D)可見(jiàn)大量染色陽(yáng)性的神經(jīng)纖維，較多的長(zhǎng)入瘢痕內(nèi)，星形細(xì)胞出現(xiàn)明顯的功能活躍，肥大，突起增多。治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯增多；聯(lián)合組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EPO組、BMSCs組明顯增多(P<0.05)。

圖3 各組治療后21天NF-M表達(dá)情況(DAB×400) A：對(duì)照組；B：EPO組；C：BMSCs組；D：聯(lián)合治療組

3 討 論

研究表明BMSCs移植能有效促進(jìn)損傷脊髓功能的恢復(fù)[9-10]。BMSCs保護(hù)神經(jīng)的作用機(jī)制可能是:(1)BMSCs可以分泌NGF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的生成和軸突生長(zhǎng)，對(duì)受損的神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用與修復(fù)作用[8]；(2)移植的BMSCs可作為軸突再生的支架，引導(dǎo)軸突向前生長(zhǎng)，抑制癱痕形成，建立新的突觸聯(lián)系，重建神經(jīng)通路；(3)BMSc可以促進(jìn)新生血管的生成與血管重建，改善受損神經(jīng)的血供，為受損神經(jīng)提供營(yíng)養(yǎng)[8];(4)免疫調(diào)控作用:BMSc可以通過(guò)自身免疫過(guò)程，阻止免疫損傷，對(duì)神經(jīng)起保護(hù)功能[11]；(5)BMSc減輕細(xì)胞凋亡水平，激活休眠狀態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)[12]。

傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中，EPO被認(rèn)為是一種促進(jìn)紅細(xì)胞增殖，糾正貧血的內(nèi)分泌激素。近來(lái)EPO已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)是一種新型的神經(jīng)保護(hù)劑[13]。EPO通過(guò)與促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制有以下幾點(diǎn)：(1)EPO在早期可以維持損傷脊髓的血供，并可以促進(jìn)局部血管的生成，提高損傷脊髓對(duì)缺血、缺氧的耐受性[14]；(2)EPO可以通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少神經(jīng)功能缺失，并能抑制局部的炎癥反應(yīng)，為脊髓的恢復(fù)創(chuàng)造有利的局部?jī)?nèi)環(huán)境[15]；(3)EPO是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，增加神經(jīng)元的生成[16]。研究表明NF-M在神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激后表達(dá)發(fā)生明顯的改變，可通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞骨架和抑制軸突回縮而促進(jìn)軸突延長(zhǎng)，起到促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[17]。

本實(shí)驗(yàn)中治療后第21天,對(duì)照組較多空腔，神經(jīng)纖維及細(xì)胞變性壞死。聯(lián)合組脊髓組織脊髓組織中無(wú)明顯空腔，脊髓有許多增生組織填充，損傷脊髓周?chē)芤?jiàn)到較完整的神經(jīng)細(xì)胞；聯(lián)合組可見(jiàn)更多的NF-M陽(yáng)性細(xì)胞，明顯多于EPO、BMSCs單獨(dú)治療組。再結(jié)合各組的BBB評(píng)分與組織學(xué)觀察可見(jiàn)聯(lián)合組神經(jīng)損傷凋亡明顯減輕，神經(jīng)軸突再生顯著增多，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)；機(jī)制可能為EPO與BMSCs表達(dá)的EPO受體結(jié)合后動(dòng)員BMSCs進(jìn)入損傷區(qū);此外，EPO為移植的BMSCs創(chuàng)造有利于生存的局部?jī)?nèi)環(huán)境，促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞，替代死亡的神經(jīng)細(xì)胞，分泌大量的NF-M穩(wěn)定細(xì)胞骨架，促進(jìn)軸突再生、再通，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。EPO調(diào)節(jié)局部血管，維持供血及供氧，兩者共用具有協(xié)調(diào)作用。

總之，脊髓損傷的再生修復(fù)是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，是一個(gè)世界性的難題。原因之一是因?yàn)槿狈线m的微環(huán)境，限制了損傷神經(jīng)軸突的再生。EPO能改善損傷局部的微環(huán)境，抑制細(xì)胞凋亡，有利于移植的BMSCs在體內(nèi)存活、分化增加，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。EPO與BMSCs聯(lián)合移植后，增加了存活細(xì)胞及分化為神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量，替代變形凋亡的神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)軸突的再生與再通，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。EPO與BMSCs聯(lián)合治療具有協(xié)同效應(yīng)。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.006

2015-01-29；

2015-05-02

*通訊作者，E-mail:Mingzhiyang@126.com

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(此文編輯：蔣湘蓮)