，

(南華大學附屬南華醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽 421001)

·基礎醫(yī)學·

紫杉醇對Caski細胞增殖及APC、DKK-3基因表達的影響

唐群華，孫曉紅*

(南華大學附屬南華醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽 421001)

目的研究紫杉醇對Caski細胞增殖及APC、DKK-3基因表達的影響。方法用MTT法、RT-PCR法及甲基化特異性PCR分別檢測紫杉醇對人宮頸癌Caski細胞株增殖的影響、APC與DKK-3 mRNA 表達水平、APC與DKK-3啟動子甲基化水平。結果≥1 μmol/L紫杉醇能明顯抑制人宮頸癌Caski細胞株的增殖 (P<0.05)；從5 μmol/L開始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大，Caski細胞APC、DKK-3 mRNA表達水平明顯增加 (P<0.05)，而Caski細胞APC 、DKK-3啟動子甲基化水平顯著降低 (P<0.05)。結論紫杉醇能呈劑量依賴性的抑制Caski 細胞的增殖并上調(diào)APC、DKK-3 mRNA的表達，這可能與其誘導APC、DKK-3啟動子的去甲基化有關。

宮頸癌； 紫杉醇； 啟動子甲基化； APC； DKK-3

轉(zhuǎn)移和復發(fā)是導致宮頸癌患者死亡的主要原因,以順鉑為基礎的化療是轉(zhuǎn)移性和復發(fā)性宮頸癌的治療標準方案，紫杉醇常與順鉑等鉑類抗腫瘤藥物聯(lián)合使用并發(fā)揮了重要的作用[1]。但紫杉醇是通過何種信號途徑啟動抗腫瘤效應的，目前還不十分清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇能通過降低乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞株中PTPRO基因啟動子甲基化水平促進其表達，抑制乳腺癌細胞的增殖[2]。腫瘤抑制基因 APC 及DKK-3 是wnt/β-catenin信號通路的關鍵組成部分，APC 與 β-catenin的交互作用與宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生相關,肼屈嗪能夠通過 APC 的去甲基化和重表達而抑制宮頸癌細胞的增殖[3]。關于紫杉醇是否通過影響APC 及DKK-3基因啟動子甲基化及其表達來抑制宮頸癌腫瘤細胞，目前未見相關報道。本研究通過不同濃度的紫杉醇處理人宮頸癌Caski細胞株后，測定細胞增殖活性的改變，同時檢測APC、DKK-3基因表達水平及其啟動子甲基化水平的變化，分析表觀遺傳學修飾在紫杉醇治療宮頸癌的作用機制，為宮頸癌的防治提供科學的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1宮頸癌細胞株及其培養(yǎng)人宮頸上皮癌Caski細胞系購自武漢大學細胞保藏中心，保存于南華大學腫瘤實驗研究所-80 ℃冰箱。將Caski細胞復蘇后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)該細胞，每隔24 h換液1次，每隔48～72 h傳代1次，顯微鏡下觀察其生長情況。

1.2主要試劑紫杉醇粉劑(生物專用)購自于三維生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自于上海博升生物科技有限公司；噻唑藍購自于福州邁新生物制品公司；TRIzol購自于美國Invitrogen公司；PBL DNA購自于美國Promega公司；RNase A 購自于美國Sigma公司；蛋白酶K 購自于美國羅氏診斷；所用引物及探針均由Invitrogen公司合成。

1.3 MTT比色法檢測不同濃度紫杉醇對人宮頸癌Caski細胞抑制率的影響細胞用不同濃度的紫杉醇 (0、1、5、10、20、40、80、160、 320 μmol/L ) 連續(xù)處理72 h，每個處理劑量設置6個復孔，每隔24 h 換1次液。分別在0 h、24 h、48 h和72 h加入MTT，在酶聯(lián)免疫檢測儀 570 nm 波長處測定吸光度值 (OD)。按下面的公式計算：細胞抑制率 (%) =[(A570對照組-A570實驗組)/A570對照組] × 100%。

1.4 RT-PCR法測定APC、DKK-3 mRNA表達水平選取處于對數(shù)生長期的Caski細胞，按每10 cm2培養(yǎng)面積加1 mL TRIzol裂解細胞，提取細胞RNA，用OD260/OD280 比值來衡量 RNA的純度。引物如下：APC-上游:5′-GAG ACA GAA TGG AGG TGC TGC-3′;APC-下游:5′-GTA AGA TGA TTG GAA TTA TCT TCT-3′;DKK-3-上游:5′-GTA AGT TTC CCC TCT GGC TTG-3′;DKK-3-下游:5′-AAG CAC CAG ACT GTG AAG CCT-3′;GAPDH-上游:5′-AAC GGA TTT GGT CGT ATT GGG-3′;GAPDH-下游:5′-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CGC-3′。APC反應條件：95 ℃ 5 min，35個PCR循環(huán) (95 ℃ 30 s、56 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s)，72 ℃延伸 7 min；DKK-3反應條件：95 ℃ 5 min，35個PCR循環(huán) (94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸 7 min。反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，進行成像分析，計算目的基因mRNA 與內(nèi)參 GAPDH mRNA 的光密度比值。

1.5 APC、DKK-3啟動子甲基化分析收集處于對數(shù)生長期的Caski細胞，加入2 mL 預熱的裂解緩沖液，用等體積的酚/氯仿/異戊醇 (1∶1∶0.04) 提取基因組DNA。50 ℃ 處理 16 h 后，DNA與5.5 μL 3 mol/L NaOH 在37 ℃ 一起孵育10 min，隨后加入 30 μL新鮮配制的 10 mmol/L對苯二酚和 520 μL 新鮮配制的3.6 mol/L 的亞硫酸氫鈉 (pH 5.0)。脫鹽等處理后應用 MethyLight quantitative PCR進行擴增并用7500/7500 快速實時 PCR 系統(tǒng)進行熒光定量檢測。引物如下[4-6]：

APC-sense：5′- GAA CCA AAA CGC TCC CCAT -3′；APC -antisense： 5′- TTA TAT GTC GGT TAC GTG CGT TTA TAT -3′；probe:5′- CCC GTC GAA AAC CCG CCG ATT A -3′；Dkk-3-sense：5′- GTA AGT TTC CCC TCT GGC TTG-3′；Dkk-3-antisense：5′- AAG CAC CAG ACT GTG AAG CCT-3′；probe:5′- AGG TGT TGT GCA TTT GTT C AG CTC CC -3′；ALU-C4-sense：5′-GGT TAG GTA TAG TGG TTT ATA TTT GTA ATT TTA GTA -3′；ALU-C4 -antisense： 5′- ATT AAC TAA ACT AAT CTT AAA CTC CTA ACC TCA -3；probe:5′- CCT ACC TTA ACC TCC C -3′。經(jīng)過初始變性 (95 ℃,10 min)、45 個變性循環(huán) (95 ℃,10 min) 以及最后的退火/延伸循環(huán) (60 ℃,1 min)。甲基化比率通過絕對化的 qPCR 定量來測定。在待測樣本中靶基因的擴增量被用 Alu-C4 進行標準化，經(jīng)M.SssI 處理的 DNA 作為甲基化的參考。在特殊位點的甲基化 DNA 的量或甲基化參考比例 (PMR)是通過劃分基因來計算的：Alu-C4 的比例為M.SssI 處理的人類基因組 DNA 的Alu-C4 的比例 (假定完全甲基化) 乘以100，即(樣本基因/樣本Alu-C4)/(SssI處理的樣本基因 / SssI處理的樣本Alu-C4)×100。

2 結 果

2.1不同濃度紫杉醇對宮頸癌Caski細胞株活性的影響分別檢測紫杉醇作用24 h、48 h及72 h后對Caski細胞的抑制率，如表1所示，用1 μmol/L的紫杉醇作用時，24 h、48 h及72 h時點Caski細胞抑制率沒有明顯的變化 (P>0.05)；從5 μmol/L開始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時間的延長，Caski細胞的抑制率顯著增大 (P<0.05)；各個劑量組均在72 h處顯示對Caski細胞的最大抑制率，其中320 μmol/L紫杉醇在72 h時對Caski細胞的抑制率達到最大(P<0.05)。

表1不同濃度紫杉醇(μmol/L)對宮頸癌Caski細胞作用不同時間的抑制率(%)

紫杉醇濃度24h48h72h000017.32±2.44a7.41±3.05a8.01±2.78ab530.78±2.34a32.13±2.34ab35.48±2.89ab1032.15±3.02a35.78±3.14ab40.18±2.73ab2033.51±2.73a37.55±2.71ab43.43±2.85ab4034.83±2.08a41.43±2.66ab47.68±2.74ab8036.46±2.71a48.61±2.59ab51.68±2.99ab16038.02±3.00a49.27±2.77ab55.34±2.17ab32040.68±2.80a56.85±2.61ab62.27±3.15ab

a：與同時點的前一個劑量組比較，P<0.05；b：與同一劑量組的前一個時點比較，P<0.05

2.2紫杉醇對Caski細胞APC、DKK-3 mRNA表達的影響檢測紫杉醇作用72 h后APC、DKK-3 mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)用1 μmol/L的紫杉醇作用時，Caski細胞APC、DKK-3 mRNA表達水平?jīng)]有明顯的變化 (P>0.05)；從5 μmol/L開始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大，Caski細胞APC、DKK-3 mRNA表達水平明顯增加 (P<0.05)，其中，320 μmol/L紫杉醇處理組APC、DKK-3 mRNA水平最高(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測紫杉醇對Caski細胞APC、DKK-3 mRNA表達水平的影響. 1～9分別為0、1、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L紫杉醇處理組. 與前一個劑量組比較，*：P<0.05

2.3紫杉醇對Caski細胞APC、DKK-3啟動子甲基化水平的影響分別檢測紫杉醇作用24 h、48 h及72 h后對Caski細胞APC 、DKK-3啟動子甲基化水平的影響，如表2所示，用1 μmol/L的紫杉醇作用時，24 h、48 h及72 h時點Caski細胞APC啟動子甲基化水平?jīng)]有明顯的變化 (P>0.05)，而48 h和72 h時點DKK-3啟動子甲基化水平明顯低于24 h時點的DKK-3啟動子甲基化水平 (P<0.05)，48 h和72 h時點間沒有明顯的差異 (P>0.05)；從5 μmol/L開始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時間的延長，Caski細胞APC、DKK-3啟動子甲基化水平顯著降低 (P<0.05)；各個劑量組Caski細胞APC、DKK-3啟動子甲基化水平均在72 h處顯示最低 (P<0.05)。

表2不同濃度紫杉醇(μmol/L)對宮頸癌Caski細胞APC、DKK-3啟動子甲基化的影響

紫杉醇濃度APC啟動子甲基化水平24h48h72hDKK-3啟動子甲基化水平24h48h72h0125±3.2128±6.8127±7.1159±2.6155±5.1157±6.61120±2.8a119±8.0a121±8.7a147±8.2a127±2.5ac125±6.6ac590±8.6a80±7.2ab60±7.5ab129±5.7a128±8.0114±8.7ab1080±6.8a60±5.6ab40±4.4ab110±5.8a105±7.3a95±5.4ab2070±7.9a55±8.8ab35±5.4ab87±8.2a95±7.1a75±7.7ab4060±8.9a45±9.2ab30±4.0ab70±5.7a65±4.9ab50±3.9ab8050±6.7a40±6.6ab25±4.2ab51±6.7a47±9.0a40±7.1ab16040±8.2a30±9.1ab20±8.8ab43±4.2a36±4.6ab38±7.132035±6.3a20±7.8ab10±5.5ab35±4.9a21±3.7ab15±4.5ab

與同時點的前一個劑量組比較，a：P< 0.05；與同一劑量組的前一個時點比較，b：P<0.05；與24 h比較，c：P<0.05

3 討 論

全球每年有50多萬女性罹患宮頸癌，國內(nèi)宮頸癌每年有13.2萬新發(fā)病例，占世界總數(shù)28%[7]。對于宮頸癌患者，目前臨床化療方案以鉑類為主，但鉑類藥物對患者的毒性作用，尤其是腎毒性以及腫瘤細胞的耐藥性日益突出。因此，尋找新的毒性及耐藥性弱的化療藥物，對于宮頸癌患者的治療具有重要的現(xiàn)實意義。紫杉醇是一線的抗腫瘤藥物。紫杉醇對卵巢癌和乳腺癌細胞有明顯的殺傷作用[8-9]，在體外有明顯的放射增敏作用[10]。紫杉醇可在肺癌細胞中通過下調(diào)let-7f的水平而上調(diào)血小板反應蛋白-1(TSP-1)的水平，從而達到抗腫瘤效應[11]。Wen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇脈沖式的治療有助于克服乳腺癌細胞對于紫杉醇的賴藥性，其主要的機制可能與降低腫瘤細胞對已經(jīng)破壞的線粒體的修復作用有關[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)wnt信號通路的LEF1/磷酸化β-catenin的表達，能改善紫杉醇對腎細胞癌的治療效果。近年來，將紫杉醇與鉑類藥物聯(lián)合用于宮頸癌的治療，取得了較好的效果。但紫杉醇抑制宮頸癌細胞的具體機制還不是十分清楚。

藥物對細胞活性的影響是藥效學評價最常用的手段。MTT法是測定細胞活性的最經(jīng)典的實驗之一?；罴毎€粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，細胞沉積的甲瓚越多，則表示細胞的活力就越強。因此甲瓚生成的多少代表細胞活力的強弱。在本研究中，用1 μmol/L的紫杉醇作用時，24 h、48 h及72 h時點Caski細胞抑制率沒有明顯的變化；從5 μmol/L開始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時間的延長，Caski細胞的抑制率顯著增大；各個劑量組均在72 h處顯示對Caski細胞的抑制率大于處理24 h、48 h的抑制率，其中320 μmol/L紫杉醇在72 h時點對Caski細胞的抑制率達到最大，表明紫杉醇能夠?qū)θ藢m頸癌Caski細胞產(chǎn)生明顯的劑量依賴和時間依賴的抑制效應，這種現(xiàn)象在其它抗腫瘤藥物實驗中也被觀察到[3]。

甲基化是研究最為廣泛的表觀遺傳學形式，基于Taqman探針的甲基化特異性PCR是較敏感的甲基化檢測方法。APC是一種廣泛表達的多功能蛋白，能夠與細胞內(nèi)多種蛋白相互作用，研究最徹底的是其能誘導β-catenin的降解，后者為鈣粘合蛋白復合體的亞基及wnt信號通路的關鍵效應器。當綁定到β-catenin后，APC促進了高保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化而激活蛋白酶體系統(tǒng)來降解β-catenin[13-14]。DKK-3是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，參與細胞周期的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)歸有密切的關系[15]。DKK-3在肝癌、宮頸癌、急性淋巴細胞白血病、胰腺癌和髓母細胞瘤等惡性腫瘤中表達減少[16]，而且這種減少與DKK-3的高甲基化狀態(tài)有關[15]。

腫瘤細胞總體基因組水平的超甲基化能夠影響腫瘤細胞對紫杉醇治療的敏感性[17]。研究顯示，APC啟動子區(qū)域CpG位點的甲基化改變與細胞異常及惡化有關[18-19]。DKK-3基因啟動子甲基化及基因表達下降已經(jīng)在膀胱癌、肺癌等多種腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)[20-21]。APC和DKK-3基因均與腫瘤細胞的生長與增殖顯著相關，主要是因為APC和DKK-3基因啟動子的超甲基化導致APC和DKK-3基因表達缺失引起[22-23]。在宮頸癌中還未發(fā)現(xiàn)APC、DKK-3基因啟動子甲基化的相關報道。

在本研究中，用1 μmol/L紫杉醇作用時，24 h、48 h及72 h時點Caski細胞APC啟動子甲基化水平?jīng)]有明顯的變化；而48 h和72 h時點Caski細胞DKK-3啟動子甲基化水平明顯低于24 h時點的DKK-3啟動子甲基化水平，48 h和72 h時點間沒有明顯的差異。從5 μmol/L開始，隨著紫杉醇給藥劑量的增大及紫杉醇處理時間的延長，Caski細胞APC、DKK-3啟動子甲基化水平顯著降低而隨著紫杉醇給藥劑量的增高，APC、DKK-3 mRNA表達水平顯著升高；各個劑量組Caski細胞APC、DKK-3啟動子甲基化水平均在72 h處低于處理24 h、48 h的水平，其中320 μmol/L紫杉醇組處理Caski細胞72 h時APC、DKK-3啟動子的甲基化水平最低，而APC、DKK-3 mRNA表達水平最高，表明紫杉醇能夠促進APC、DKK-3基因的表達，這種現(xiàn)象可能與其能夠呈劑量依賴性的降低宮頸癌Caski細胞APC、DKK-3基因啟動子的甲基化水平有關，但其具體機制還需進一步研究。

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EffectsofPaclitaxelonCellProliferationandExpressionofAPCandDKK-3inHumanCervicalCancerCaskiCells

TANG Qunhua,SUN Xiaohong

(ObstetricsandGynecologyDepartment,theAffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo study the effect of paclitaxel on the proliferation of Caski cells and the expression of APC,DKK-3 gene.MethodsMTT colorimetric method,RT-PCR method and methylation specific PCR were used to detect the proliferation effects,the mRNA expression level of APC and DKK-3,APC and DKK-3 promoter methylation level induced by paclitaxel on human cervical carcinoma Caski cell line,respectively.ResultsPaclitaxel significantly inhibited the proliferation of Caski cervical cancer cell line when the concentration of Paclitaxel was more than 1 μmol/L (P<0.05);Starting from concentration of 5 μmol/L,with increasing of paclitaxel dosage,APC and DKK-3 mRNA expression level increased significantly (P<0.05),while APC and DKK-3 promoter methylation level significantly decreased (P<0.05).ConclutionPaclitaxel could dose-dependently inhibit the proliferation of Caski cells through increasing APC and DKK-3 mRNA expression,which may be related with the inhibition of APC and DKK-3 promoter methylation.

cervical cancer; paclitaxel; promoter methylation; APC; DKK-3

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.005

2015-03-01；

2015-04-06

*通訊作者，E-mail：402447821@qq.com.

R737.33

A

(此文編輯：朱雯霞)