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(衡陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421001)

肺炎嗜衣原體包涵體膜蛋白Cpn0147誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8

吳華，卿文衡，劉軍，張黎黎

(衡陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421001)

目的探討肺炎嗜衣原體(Cpn)包涵體膜蛋白Cpn0147誘導(dǎo)人單核細(xì)胞分泌炎癥因子的分子機(jī)制。方法用去除內(nèi)毒素活性的不同濃度Cpn0147重組蛋白(1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL)刺激THP-1細(xì)胞0～48 h，ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)的分泌水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNF-α和IL-8 mRNA的表達(dá)；用Toll樣受體2(TLR2)和TLR4中和抗體處理THP-1細(xì)胞，或采用TLR2和TLR4 siRNA沉默其表達(dá)，ELISA檢測(cè)THP-1處理前后TNF-α和IL-8分泌的變化。結(jié)果Cpn0147可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-8的mRNA和蛋白；同時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)Cpn0147對(duì)TNF-α和IL-8的誘導(dǎo)水平有所不同，Cpn0147作用2～6 h后即可誘導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌，12 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。采用TLR2和TLR4中和抗體封閉THP-1細(xì)胞后，TNF-α和IL-8分泌水平明顯減少，采用TLR2和TLR4 siRNA干擾其表達(dá)后，TNF-α和IL-8的分泌也得到了類似的結(jié)果。結(jié)論Cpn0147 可能通過TLR2和TLR4介導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌。

肺炎嗜衣原體； Toll樣受體2； Toll樣受體4； 腫瘤壞死因子-α； 白介素-8

肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumonia,Cpn)是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生、具有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物。作為一種常見的呼吸系統(tǒng)感染因子，Cpn除可引起呼吸道的急、慢性感染、支氣管炎和哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病外，還和動(dòng)脈硬化等多種慢性疾病相關(guān)[1]。Cpn的致病機(jī)制目前尚未完全明了，但其感染所致的炎癥反應(yīng)是多種疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。研究表明，衣原體包涵體膜蛋白在致病過程中發(fā)揮重要作用。它不但可激活單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮促炎作用，同時(shí)也可通過TLR2和TLR4誘導(dǎo)T細(xì)胞增值，并能促進(jìn)衣原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、侵襲，或參與其免疫逃避等過程[2,3]。因此，研究包涵體膜蛋白的功能，對(duì)了解其在衣原體致病中的作用具有重要意義。Cpn0147是本課題組鑒定出的一種包涵體膜蛋白。前期研究表明，Cpn0147基因高度保守，并具有良好的免疫原性[4]，但其對(duì)宿主細(xì)胞是否具有促炎活性目前尚未完全明了，本研究旨在觀察體外重組蛋白能否誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑pGEX-6p-2載體原核表達(dá)重組菌由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存；人單核細(xì)胞THP-1購自ATCC。HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、Amicon? Ultra-15蛋白超濾管購自Millipore；抗TLR2和TLR4中和抗體購自Novus Biologicals；Ni-NTA Spin Kit購自Qiagen公司；TNF-α和IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen；TLR2和TLR4 siRNA購自Santa Cruz。siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒購自Qiagen。

1.2無內(nèi)毒素的Cpn0147的制備與細(xì)胞培養(yǎng)按照本課題組前期方法對(duì)Cpn0147進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)[4]。利用去內(nèi)毒素純化柱過柱后，采用蛋白超濾管對(duì)其進(jìn)行濃縮、測(cè)定濃度后低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，4.5 mg/mL L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。2～3天換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?xì)胞加入不同濃度的1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL作用0～48 h。

1.4細(xì)胞因子檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)Cpn0147處理結(jié)束后，離心棄上清，采用連續(xù)凍融2次以充分裂解細(xì)胞。1 000 rpm離心10 min后，獲取上清測(cè)定TNF-α和IL-8含量。操作方法按照試劑盒提供的雙抗體夾心法進(jìn)行。通過測(cè)定450 nm處的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分泌至細(xì)胞外的TNF-α和IL-8含量。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)根據(jù)試劑盒操作步驟提取細(xì)胞總RNA，并取3 μg的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。本文所用引物如下：TNF-α上游引物為5′-GCCCAGGCAGTCAGATCATC，下游引物為5′-CGGTTCAGCCACTGGAGCT-3′;IL-8上游引物為5′-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT-3′；下游引物為5′-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3′；GAPDH上游引物為5′-ACCAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游引物為：5′-TGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′，在定量PCR儀(ABI 7500)上按以下程序擴(kuò)增：95 ℃ 2 min，隨后按照以下程序擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。PCR結(jié)束后計(jì)算各處理組中HO-1的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式：2-ΔΔCt，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(CtTNF-α/IL-8-CtGAPDH)-對(duì)照組(Ct TNF-α/IL-8-CtGAPDH)。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA轉(zhuǎn)染前，THP-1細(xì)胞更換為無血清培養(yǎng)基同步18h，隨后將其接種于6孔板中(密度約為5×105/mL)。siRNA轉(zhuǎn)染按照Qiagen公司的試劑盒操作步驟進(jìn)行，將100 nmol/L TLR2或TLR4 siRNA或?qū)φ誷iRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合后孵育18 h。隨后更換為完全培養(yǎng)基用于下一步研究。

1.7 Western blot 采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(25 mmol/L Tris-HCl pH7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，1% SDS)裂解細(xì)胞，并用Bradford法于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白經(jīng)8%～10% SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗和HRP標(biāo)記二抗孵育，ECL顯影。

2 結(jié) 果

2.1 Cpn0147誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞TNF-α和IL-8 mRNA的表達(dá)THP-1細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下TNF-α和IL-8表達(dá)量很低。當(dāng)分別給予1.0、10.0、30.0和50.0 μg/mL Cpn0147刺激細(xì)胞8 h后，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示TNF-α和IL-8 mRNA表達(dá)量隨著Cpn0147濃度的遞增而增加(圖1)。

2.2 Cpn0147誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8

ELISA結(jié)果顯示，未經(jīng)刺激的THP-1細(xì)胞TNF-α和IL-8分泌水平很低。經(jīng)不同濃度重組Cpn0147刺激后12 h后，細(xì)胞上清中TNF-α和IL-8分泌水平顯著增高，其中50 μg/mL Cpn0147作用后，TNF-α和IL-8含量分別達(dá)(486.34±33.62)pg/mL和(125.47±16.08)pg/mL(圖2)。

圖1 不同濃度Cpn0147誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-8 mRNA 與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，*：P<0.05，**：P<0.01

圖2 不同濃度Cpn0147誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8 與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，*：P<0.05，**：P<0.01

2.3 Cpn0147誘導(dǎo)TNF-α和IL-8依賴持續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯不同濃度的RNA合成抑制劑放線菌素(ActD)和翻譯水平的抑制劑放線菌酮(CHX)預(yù)處理THP-1細(xì)胞后，ELISA結(jié)果顯示，TNF-α和IL-8分泌顯著降低(圖3)。

圖3 放線菌素和放線菌酮對(duì)Cpn0147誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8的影響 與Cpn0147(50 μg/mL)相比，*：P<0.05

2.4 Cpn0147不同時(shí)間誘導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌

不同時(shí)間點(diǎn)Cpn0147對(duì)TNF-α和IL-8的誘導(dǎo)水平有所不同，Cpn0147作用2～6 h后即可誘導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌，12 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降(圖4)。

圖4 Cpn0147不同時(shí)間誘導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌

2.5 TLR2和TLR4中和抗體抑制TNF-α和IL-8分泌THP-1細(xì)胞與5 μg/mL TLR2或TLR4抗體預(yù)孵育1 h，隨后加入50 μg/mL Cpn0147刺激12 h，結(jié)果顯示TLR2和TLR4中和抗體處理后，TNF-α和IL-8分泌水平明顯降低(圖5)。

圖5 TLR2和TLR4中和抗體對(duì)Cpn0147誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8的影響 與Cpn0147(50 μg/mL)相比，*：P<0.05

2.6沉默TLR2和TLR4表達(dá)下調(diào)TNF-α和IL-8分泌采用siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，分別使其沉默TLR2和TLR4表達(dá)(圖6A)。隨后加入50 μg/mL Cpn0147刺激12 h，結(jié)果顯示RNA干擾TLR2和TLR4表達(dá)后，TNF-α和IL-8分泌水平明顯降低(圖6)。

3 討 論

圖6 TLR2和TLR4 siRNA對(duì)Cpn0147誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8的影響 與對(duì)照siRNA(Con)相比，*：P<0.05

相對(duì)其他致病性較強(qiáng)的病原微生物(如沙眼衣原體)而言，Cpn毒力相對(duì)較低，其感染人體后并不直接導(dǎo)致嚴(yán)重的病理損傷。但如果Cpn慢性持續(xù)性感染后，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子以及炎性相關(guān)介質(zhì)的產(chǎn)生，從而造成持續(xù)的炎癥反應(yīng)[5]。Cpn0147為本課題組近期鑒定出來的一種包涵體膜蛋白，它定位于包涵體上，并且具有非常強(qiáng)的抗原性和免疫原性[4]。包涵體膜是宿主細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的重要場(chǎng)所，其膜蛋白參與了衣原體的生長(zhǎng)與致病過程[3]。由于炎癥是機(jī)體感染Cpn后所產(chǎn)生的一種免疫反應(yīng)，它在發(fā)揮保護(hù)性防御反應(yīng)的同時(shí)，也參與了Cpn所致的病理損傷[6,7]。為檢測(cè)Cpn0147是否為一種炎癥誘導(dǎo)物，本研究采用去除內(nèi)毒素的純化重組蛋白Cpn0147以不同劑量、不同作用時(shí)間體外刺激單核細(xì)胞系THP-1，采用ELISA和實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)TNF-α和IL-8蛋白以及mRNA的表達(dá)進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示，Cpn0147與陰性對(duì)照組相比，可顯著誘導(dǎo)TNF-α和IL-8的產(chǎn)生，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，在1～50 μg/mL范圍內(nèi)，隨著Cpn0147蛋白濃度的增高，TNF-α和IL-8分泌水平也逐漸升高。并且在50 μg/mL Cpn0147作用8～12 h后，培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-8水平達(dá)到最峰值，然后逐漸下降。而采用RNA合成抑制劑放線菌素和翻譯水平的抑制劑放線菌酮處理后，TNF-α和IL-8的分泌明顯降低，這表明Cpn0147誘導(dǎo)其分泌依賴持續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。TNF-α是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的促炎細(xì)胞因子之一，在炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早，能通過與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，可實(shí)現(xiàn)其抗感染與免疫調(diào)節(jié)功能，同時(shí)還可以進(jìn)一步促進(jìn)IL-lβ和IL-6的合成以增強(qiáng)組織細(xì)胞敏感性。此外，也有研究證實(shí)高膽固醇高脂血癥男性患者頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)可以檢測(cè)到高濃度的Cpn和TNF-α，這也提示Cpn感染以及TNF-α與心腦血管疾病有關(guān)[8]。IL-8是CXC 家族重要的趨化因子，它可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞粘附并滲出至炎癥部位，最終促進(jìn)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，釋放各種蛋白水解酶和產(chǎn)生大量的氧自由基，參與局部炎癥部位[9]。

衣原體感染后，機(jī)體免疫系統(tǒng)主要通過Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。有研究顯示，衣原體熱休克蛋白60可能通過TLR4/MAPKs途徑誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增生[10]，在識(shí)別Cpn過程中，TLR2可能發(fā)揮更重要的作用[11]。 為了進(jìn)一步觀察Cpn0147誘導(dǎo)TNF-α和IL-8分泌是否與TLR有關(guān)，本研究首先采用TLR2和TLR4中和抗體預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果顯示通過抗體封閉TLR2和TLR4后，TNF-α和IL-8分泌顯著降低。隨后采用siRNA沉默TLR2和TLR4后，也得到了類似的結(jié)果。目前有關(guān)Cpn重組蛋白與TLR的關(guān)系，還存在爭(zhēng)議，其原因主要在于重組Cpn0147制備過程中雖然有被內(nèi)毒素污染的可能[6]，但本研究在純化Cpn0147過程中，采用了去內(nèi)毒素純化柱進(jìn)行純化，并采用鱟試劑對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)，其水平在60 pg/mL以下。這表明Cpn0147被內(nèi)毒素污染的可能性很小。

總之，Cpn所致炎癥反應(yīng)是一種復(fù)雜的生理和病理過程，一方面它是機(jī)體清除衣原體感染所必須，另一方面，過度的炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致病理損傷的重要因素。在該過程中，各種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡直接決定了炎癥反應(yīng)的最終結(jié)局。如何在兩者之間尋求平衡是今后研究工作所面臨的復(fù)雜問題。

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Chlamydophilapneumonia-DerivedInclusionMembraneProteinCpn0147InducesMonocytesSecretionofTNF-αandIL-8

WU Hua,QING Wenheng,LIU Jun,et al

(Theclinicallaboratory，CenterHospitalofHengyangCity;Hengyang,Hunan,421001,China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of the inclusion membrane protein Cpn0147 on the secretion of cytokines in monocytes.MethodsCultured THP-1 cells were stimulated with different concentration of endotoxin-free recombinant inclusion protein (1.0,10.0,30.0 and 50.0 μg/mL) for 0～48 h.Secretion of TNF-α and IL-8 were detected by ELISA,expression of the mRNA was measured by real-time PCR.In addition,cells were preincubated with Toll-like receptor 2(TLR2) or TLR4 neutralizing antibody,or transfected with siRNA for TLR2 and TLR4,secretion of TNF-α and IL-8 were detected by ELISA.ResultsCpn0147 could induce THP-1 cells the secretion of TNF-α and IL-8,and the expression of mRNA.The production of TNF-α and IL-8 varies with time intervals,the ELISA results indicated secretion of cytokines appeared after 2～6 h of stimulation,peaked at 12 h and then decreased.Pre-incubation of TLR2 or TLR4 neutralizing antibody significantly abrogate Cpn0147-induced cytokines production,similar results was also obtained by RNA interference of TLR2 and TLR4.ConclusionCpn0147 can induce TNF-α and IL-8 secretion via TLR2 and TLR4.

Chlamydophila pneumonia; Toll-like receptor 2; TLR4; TNF-α; IL-8

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.004

2015-09-10；

2015-11-10

湖南省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(B2013-132).

*通訊作者，E-mail：Wuhua924@163.com.

R392.12

A

(此文編輯：秦旭平)