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(湖南中醫(yī)藥大學(xué)仲景學(xué)說(shuō)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208))

加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠炎癥標(biāo)志物IL-6和TNF-α的調(diào)節(jié)作用

謝雪姣1，李亞梅，徐佳，廖端芳*，吳若霞，尹棟梁，陳聰伶

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)仲景學(xué)說(shuō)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208))

目的研究加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠血清、主動(dòng)脈壁及瓣膜的IL-6、TNF-α表達(dá)的影響。方法40只ApoE-/-小鼠中10只為空白對(duì)照組，30只以高脂飼喂養(yǎng)4周構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化(As)小鼠模型，均分成模型組、辛伐他汀組、加味二陳湯組，分別用生理鹽水、辛伐他汀及加味二陳湯對(duì)小鼠灌胃給藥，8周后處死小鼠，Elisa法檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α的含量；免疫組化法檢測(cè)IL-6、TNF-α在主動(dòng)脈壁及瓣膜的表達(dá)。結(jié)果辛伐他汀組血清IL-6和TNF-α分別為392.06±37.70 pg/mL、189.1±50.4 pg/mL，與模型組相比表達(dá)下降(P<0.05)；加味二陳湯組血清IL-6、TNF-α分別為442.41±172.26 pg/mL、47.2±13.3 pg/mL，與模型組相比表達(dá)下降(P<0.05)，與辛伐他汀組相比，表達(dá)下降(P<0.05)；免疫組化結(jié)果顯示加味二陳湯可降低IL-6、TNF-α在主動(dòng)脈壁內(nèi)的表達(dá)。結(jié)論加味二陳湯可降低血清和主動(dòng)脈壁及瓣膜的IL-6、TNF-α的表達(dá)。

加味二陳湯； 動(dòng)脈粥樣硬化； TNF-α； IL-6

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosc1erosis，As)是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)疾病之一，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)[1],2010年全球死于缺血性心臟病和中風(fēng)的人數(shù)約為1.29億人,且每4個(gè)死者中就有1個(gè)死于心血管疾病[2]。而我國(guó)每年在心血管疾病方面所花費(fèi)的醫(yī)療費(fèi)用及勞動(dòng)力損失總約2000億元[3]。他汀類藥物的問(wèn)世及心臟塔橋手術(shù)給冠心病患者帶來(lái)了福音，但卻有著不可避免的弊端，中醫(yī)藥在改善冠心病患者癥狀及提高生存率方面發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明二陳湯可顯著降低血中膽固醇、甘油三脂以及低密度脂蛋白的含量[4],而本文研究亦表明加味二陳湯可顯著降低小鼠血清中血清總膽固醇(TCHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平(P<0.01)，但加味二陳湯對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病“前炎癥細(xì)胞因子”IL-6及TNF-α表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1,1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7～8周齡雄性ApoE基因敲除小鼠 44 只，品系為C57BL/6J，體重 19～21 g，來(lái)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心由美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)、繁育[SCXK(京)：2011-0012][5]。實(shí)驗(yàn)操作在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK(湘)：2013-0005】。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 受試藥物 加味二陳湯由茯苓15 g、陳皮10 g、法半夏10 g、甘草6 g、荷葉10 g、山楂15 g、刺五加10 g由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室主任劉塔斯教授鑒定，加水煎煮30 min后趁熱過(guò)濾，濃縮至生藥0.5 g生藥/mL，制得煎液。高脂飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工制作，配方為豬油5%、膽固醇1%、普通飼料94%。小鼠用墊料由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.3 主要試劑 Mouse IL-6 ELISA試劑盒(RD公司，產(chǎn)品編號(hào) EIA05846)，Mouse TNF-α ELISA試劑盒(RD公司，產(chǎn)品編號(hào) EIA05897)，O·C·T compound Tissue-Tek(SaKura Finetek USA,order number 4583)，羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(PV-6001，北京中杉金橋)，兔源TNF-α抗體(ab9739，abcam公司)，兔源IL-6抗體(ab6672，abcam公司)，DAB試劑盒(753223A，北京中杉金橋)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 LEICA DM LB2型雙目顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)，Motic B5型顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)，ELISA檢測(cè)儀器(基因有限公司，型號(hào)biotek-ELX800 )。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立及給藥 44只ApoE-/-小鼠先給與適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，后隨機(jī)抽取小鼠10只，作為空白對(duì)照組(n=10)，給與普通飼料喂養(yǎng)；30只給與高脂飼料(含5%的豬油、1%的膽固醇)喂養(yǎng)，自由飲水，進(jìn)行造模；余下4只為造模檢驗(yàn)小鼠，分別與兩組予相同喂養(yǎng)(各2只)。喂養(yǎng)4周后，將造模檢驗(yàn)小鼠(類空白對(duì)照組2只，類模型組2只)，檢測(cè)小鼠血脂水平、對(duì)小鼠心臟主動(dòng)脈及主動(dòng)脈瓣行油紅O染色，綜合分析用于檢驗(yàn)AS模型是否已制備成功。再將造模組小鼠按小鼠體重采用隨機(jī)分組方法將動(dòng)物分為3組，模型組、加味二陳湯組、辛伐他汀組各10只。

模型組小鼠與空白對(duì)照組均給予生理鹽水灌胃，灌胃量與后面用藥組相同，灌胃體積均為每天20 mL/kg。辛伐他汀組小鼠給予辛伐他汀每天3 mg/kg[5]灌胃，加味二陳湯組小鼠給予其浸膏按生藥量每天2.2 g/kg灌胃，配制藥液的溶劑均為生理鹽水。

1.2.2 取材及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 各組動(dòng)物連續(xù)灌胃8周，再與12 h不禁水禁食處理，首先經(jīng)眼眶靜脈叢取血，將血液靜置2 h后，離心5 min(4 000 rpm)，取上清液即血清，在-20 ℃冰箱中保存，用于IL-6、TNF-α的檢測(cè)。用4%多聚甲醛從小鼠左心室灌流30 min，剝離主動(dòng)脈，將其在常溫條件下保存在4%多聚甲醛中。心臟在4%多聚甲醛中常溫保存24 h，取出以O(shè)CT compound包埋，保存在-20 ℃冰箱中，將用于冰凍切片。

1.2.3 小鼠血清IL-6、TNF-α含量的檢測(cè) 檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α的含量，方法按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4 小鼠主動(dòng)脈內(nèi)IL-6、TNF-α表達(dá) 冰箱中取出主動(dòng)脈切片，予以脫蠟，在室溫下采用3%H2O2孵育10 min；先以蒸餾水沖洗，再用PBS洗2次(各5 min)；洗后浸入PBS緩沖液中，微波爐加熱10 min，使液體溫度保持在95℃左右，拿出在室溫中冷卻15 min；予以5%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，在室溫中孵育10 min；除去血清，直接加稀釋后的一抗(IL-6稀釋比例為1∶40；TNF-α稀釋比例為1∶400)，孵育2 h(37℃)；使用PBS洗5 min×3次；滴加PV-6001二抗，孵育30 min(37℃)；再PBS洗5 min×3次；采用DAB顯色2 min；拿出后用自來(lái)水充分沖洗，以蘇木精復(fù)染，用水洗晾干，給予中性樹(shù)膠封片后采集圖像，供后期分析。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)IL-6在小鼠主動(dòng)脈瓣的表達(dá) 取小鼠心臟主動(dòng)脈瓣冰凍切片，放置在60 ℃烘箱中烤30 min，取出來(lái)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)IL-6在小鼠主動(dòng)脈瓣的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠血清IL-6、TNF-α表達(dá)的影響由表1可見(jiàn)，模型組血清IL-6和TNF-α的表達(dá)與空白對(duì)照組相比顯著上升(P<0.01)。與模型組相比，辛伐他汀組血清IL-6和TNF-α表達(dá)明顯下降(P<0.01)；加味二陳湯組血清IL-6、TNF-α表達(dá)下降；其中TNF-α的表達(dá)下降顯著(P<0.01)。

表1加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠血清IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

組別nTNF?α(pg/mL)IL?6(pg/mL)空白對(duì)照組1054．6±22．3b313．38±121．15b模型組10503．1±95．3a711．18±97．17a辛伐他汀組10189．1±50．4ab392．06±37．70b加味二陳湯組1047．2±13．3bc442．41±172．26bd

與空白對(duì)照組相比，a：P<0.05；與模型組相比，b：P<0.05；與辛伐他汀組相比，c：P<0.01，d：P<0.05

2.2加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)IL-6、TNF-α表達(dá)的影響主動(dòng)脈免疫組化結(jié)果表明(見(jiàn)圖1、圖2)，空白對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈大致無(wú)IL-6、TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)(黃褐色顆粒物)；模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)IL-6、TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)(黃褐色顆粒物)顯著高于空白對(duì)照組，而辛伐他汀組、加味二陳湯組主動(dòng)脈斑塊內(nèi)IL-6、TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于模型組。

圖1 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈TNF-α免疫組化結(jié)果(40×) A：空白對(duì)照組；B：模型組 ；C：辛伐他汀組； D：加味二陳湯組

圖2 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈IL-6免疫組化結(jié)果(40×) A：空白對(duì)照組；B：模型組 ；C：辛伐他汀組； D：加味二陳湯組

2.3加味二陳湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈瓣IL-6表達(dá)的影響免疫組化檢測(cè)研究顯示，模型組與空白對(duì)照組相比，其主動(dòng)脈瓣斑塊上棕黃顆粒明顯增多。辛伐他汀組和加味二陳湯組較模型組相比，其小鼠主動(dòng)脈瓣棕黃色顆粒均顯著減少。圖中棕黃色顆粒是IL-6的陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖3。

3 討 論

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈瓣IL-6免疫組化染色病理切片(40×)

迄今為止，As的發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說(shuō)，尚未完全清楚，涉及多種危險(xiǎn)因素，大量的臨床和基礎(chǔ)研究表明，其危險(xiǎn)因素包括高血壓、高脂血癥、高血糖、高半胱氨酸血癥、高纖維蛋白原血癥、高尿酸血癥、腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)活化、肥胖、吸煙、慢性應(yīng)激等，而As發(fā)病機(jī)制的學(xué)說(shuō)也眾多，公認(rèn)的有脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)(脂源性學(xué)說(shuō))、損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)、潴留反應(yīng)學(xué)說(shuō)(潴留一應(yīng)答學(xué)說(shuō))、炎癥學(xué)說(shuō)、血小板功能亢進(jìn)學(xué)說(shuō)、血管平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)、免疫功能異常學(xué)說(shuō)、Ca 超負(fù)荷學(xué)說(shuō)等[7-8]。在這眾多學(xué)說(shuō)中，炎癥機(jī)制學(xué)說(shuō)是相對(duì)新的一種學(xué)說(shuō)。眾多的研究提示炎癥反應(yīng)與As的發(fā)生發(fā)展具有直接關(guān)系,可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性持續(xù)性炎癥反應(yīng)性疾病的觀點(diǎn)由美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院ROSS教授提出后獲得廣泛認(rèn)同[9-14]。

研究表明[15]，上述As的多種危險(xiǎn)因素如吸煙、高血脂等均可促氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell，EC)損傷，內(nèi)皮受損，激活的巨噬細(xì)胞分泌IL-6，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-6可促使炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄增加，使中膜平滑肌細(xì)胞增殖并發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。在此同時(shí)釋放更多炎癥介質(zhì)，使更多單核細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊形成。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種多功能的炎性細(xì)胞因子,主要由激活的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌，參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)As的發(fā)展[16]。TNF-α還通過(guò)直接的細(xì)胞毒性作用，致使中性粒細(xì)胞脫顆粒、氧化代謝，破壞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[17]；并且可促進(jìn)IL-6的分泌，參與血管平滑肌細(xì)胞增殖、分化和調(diào)控，從而促使血管壁增厚，官腔狹窄；此外還刺激內(nèi)皮細(xì)胞激活血小板激活因子，導(dǎo)致?lián)p傷部位的血栓形成，加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。隊(duì)列研究證實(shí)[18]血清中的IL-6、TNF-α及CRP含量指標(biāo)高的人群發(fā)生冠心病等老年性疾病的概率明顯增加，其中IL-6、TNF-α預(yù)測(cè)急性事件的價(jià)值要高于CRP。因此，IL-6和TNF-α作為炎癥標(biāo)志物，檢測(cè)血清IL-6、TNF-α表達(dá)水平成為預(yù)測(cè)心腦血管事件的重要指標(biāo)，若能降低其活性和表達(dá)水平將有利于控制As進(jìn)程。

二陳湯是中醫(yī)藥常用的基礎(chǔ)方，出自宋代《太平惠民和劑局方》，因方中半夏、橘紅以陳久者良而命名為“二陳”，為祛痰的通用方劑。加味二陳湯乃二陳湯去烏梅、生姜，加荷葉、山楂、刺五加組成，方中以法夏為君，取其辛溫性燥，善能燥濕化痰，且又降逆和胃。以陳皮為臣，理氣燥濕祛痰，燥濕以助半夏化痰之力，理氣可使氣順則痰消。痰由濕生，濕自脾來(lái)，故佐以茯苓健脾滲濕，俾濕去脾旺，痰無(wú)由生；去掉降逆之生姜、酸收之烏梅，加自古奉為瘦身的良藥荷葉利尿通便、涼血消脂，山楂消食健胃、行氣散瘀，刺五加補(bǔ)肝滋腎；活血通脈，使痰濕解而不傷脾陽(yáng)；以甘草為使藥，調(diào)和藥性而兼潤(rùn)肺和中。諸藥合用，標(biāo)本兼顧，燥濕化痰，行氣消脂，活血通脈。筆者臨床將其辨證論治用之于單純性肥胖、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等疾病證屬痰濕郁結(jié)者，屢收奇效[19]。

本課題組前期研究顯示[20]，加味二陳湯與模型組相比，其血清TCHOL、LDL-C均明顯降低(P<0.05)；對(duì)小鼠主動(dòng)脈行油紅O大體染色，可見(jiàn)加味二陳湯組小鼠主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈干管腔內(nèi)脂質(zhì)沉積斑塊均明顯少于模型組，減少ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，說(shuō)明加味二陳湯具有明顯的降脂消斑功效。也有研究表明冠心病血瘀證和痰熱證患者其白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C-反應(yīng)蛋白含量、TNF-α和IL-6含量均升高，表明中醫(yī)學(xué)之“痰”、 “瘀”與炎癥因子密切相關(guān)[21]，并得到諸多驗(yàn)證[22-24]。而本實(shí)驗(yàn)表明，模型組血清IL-6、TNF-α水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，這結(jié)果也證實(shí)了血清IL-6和TNF-α升高成為冠心病重要病理因素之一。而加味二陳湯可明顯下調(diào)血清中IL-6、TNF-α的表達(dá)(P<0.05)；降低IL-6、TNF-α在主動(dòng)脈內(nèi)的表達(dá)，這為加味二陳湯辨證論治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和進(jìn)一步深入研究提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。

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TheEffectsofModified“ErchenDecoction”ontheExpressionofInflammatoryMarkerIL-6，TNF-αonApoE-/-Mice

XIE Xuejiao,LI Yamei,XU Jia,et al

(HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha,Hunan410208,China)

ObjectiveThis study was to investigate the effects of Modified Erchen Decoction on the expression of IL-6，TNF-α in the aortic wall and serum of ApoE-/-mice，in order to confirm the effect on the regulation of inflammatory factors in atherosclerosis.MethodsApoE-/-mice of the control group (n=10) were fed with normal diet,the others (n=30) were fed with a high-cholesterol diet in 4 weeks to induce atherosclerosis mode,and then were divided into the model group (n=10),the Modified Erchen Decoction group (n=10) and the simvastatin group (n=10).The two treatment groups were given Modified Erchen Decoction and simvastatin by gavage respectively.The expression of IL-6 and TNF-α was measured by ELISA kit after treated with the drugs for 8 weeks continuously.ResultsIL-6 and TNF-α in serum were 392.06±37.70 pg/mL and 189.1±50.4 pg/mL in the simvastatin group and were 47.2±13.3 pg/mL and 442.41±172.26 pg/mL in the Modified Erchen Decoction group respectively.They were decreased by the two drugs,and significant difference was found between each treatment group and the control group.The expression of IL-6 and TNF-α were decreased by the two drugs,which were confirmed by the histopathology.ConclusionModified Erchen Decoction can inhibit the expression of IL-6 and TNF-α effectively in the ApoE-/-mice,which indicates that Chinese formula may reduce atherosclerosis progress.

Modified Erchen Decoction; atherosclerosis; TNF-α; IL-6

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.002

2015-08-25；

2015-10-30

全國(guó)第五批老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承項(xiàng)目，湖南省教育廳科研青年項(xiàng)目(編號(hào)11B092);湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)201236);湖南省自然基金項(xiàng)目(編號(hào)：2015JJ6076);湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地資助

*通訊作者，E-mail：dfliao66@aliyun.com.

R541.4

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(此文編輯：蔣湘蓮)