王 斌

（甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

白三葉草（Trifolium repens Linn.），中文異名白車軸草、白花苜蓿、白花車軸草、荷蘭翹搖等，為豆科蝶形花亞科三葉草屬多年生牧草。其營養(yǎng)價值好，柔嫩多汁，適口性好，產(chǎn)草量高，可作家畜、家禽的優(yōu)質(zhì)飼料和綠肥［1-3］。同時因其生長力強，繁殖容易，綠色期長，耐踐踏，被廣泛應(yīng)用于城市綠化建設(shè)，是優(yōu)良的綠化觀賞草坪種［4］。

鏈格孢菌屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬，全世界已經(jīng)描述的約有500種［5］，其中90%以上的種是兼性寄生于不同科的植物上，可引起多種葉斑病，常稱為黑斑?。?］。周曉燕報道的白三葉草黑斑病的病原有兩種，一種為三葉草黑斑菌，屬子囊菌亞門、座囊菌目、座囊菌科、黑斑座囊菌屬，無性世代為三葉草黑斑集梗，屬半知菌亞門、叢梗孢目、集梗屈頂霉屬。另一種為三葉草多孢小球殼菌，屬子囊菌亞門、座囊菌目、座囊菌科、多孢小球殼菌屬［7］。李晶等報道，鏈格孢菌為安徽銅陵銅尾礦區(qū)的優(yōu)勢植物白車軸草葉斑病的主要致病菌［8］。白三葉草鏈格孢菌主要危害葉片、葉柄，通常為小而密集的黑色或烏黑色病斑，近圓形或不規(guī)則形，環(huán)境干燥時葉片枯黃早衰，嚴(yán)重影響白三葉草的應(yīng)用價值和觀賞性。筆者于2014年在甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物保護(hù)實驗室研究了溫度和pH對白三葉草鏈格孢菌菌落生長的影響，以期為防治白三葉草鏈格孢菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試白三葉草葉片采自湖北省武漢市。PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL。主要儀器為超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，生物顯微鏡。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

選擇具有典型癥狀的白三葉草葉片，洗凈，晾干，取新鮮病斑病健交界部分，剪取邊長4～5 mm的病組織數(shù)塊，置于滅菌小容器內(nèi)，用70%酒精漂洗2～3 s，然后用0.1%升汞溶液消毒1～2 min，再經(jīng)無菌水漂洗3～4次，然后用滅菌的濾紙吸干水分。最后將病組織放到平板培養(yǎng)基上，25℃下進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后檢查分離、鏡檢、轉(zhuǎn)管、純化。

1.3 柯赫氏法則印證

選取白三葉草健康的葉片，進(jìn)行表面消毒，放在底層鋪有吸水紙的搪瓷盤中，將純化后的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d（圖1）。在菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅接種在離體葉片上，以接種無菌的PDA培養(yǎng)基作為對照。25℃恒溫下保濕培養(yǎng)。觀察并記載發(fā)病情況，將發(fā)病葉片的病原菌再分離純化并進(jìn)行鏡檢。

圖1 離體葉片接種

1.4 不同溫度下菌絲生長觀察

設(shè) 15、20、25、30、35、40℃ 6個溫度處理，每處理3個重復(fù)。在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅，接種在不同處理培養(yǎng)基上，按設(shè)置溫度恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察記載菌落生長情況。

1.5 不同處理pH菌絲生長觀察

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)PDA培養(yǎng)基的pH至5、6、7、8、9。每處理設(shè)3個重復(fù)。在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣用打孔器打取直徑5 mm的菌餅，接種在不同pH培養(yǎng)基上，25℃下恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察記載菌落生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

如圖2所示，在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，中部黃褐色至黑色，邊緣為乳白色，短絨狀。從圖3看出，分生孢子梗褐色至暗褐色，分支或不分支，有隔。分生孢子棒狀或倒棒狀，暗褐色，0～3個縱隔，1～6個橫隔。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，鑒定該病原菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬真菌［8-10］。

2.2 溫度對菌落生長的影響

從表1可以看出，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，25℃處理下菌落生長最快，平均直徑為7.1 cm；其次是20℃處理，平均直徑為5.6 cm。35℃處理下菌落生長最慢，平均直徑為1.9 cm。40℃處理下平均直徑大于35℃處理的平均直徑，這可能跟實驗誤差有關(guān)。對菌落直徑進(jìn)行方差分析的結(jié)果表明，不同的溫度條件對鏈格孢菌的生長有顯著影響，其中25℃條件下與其余溫度條件下各處理差異極顯著；溫度過低（15℃）或過高（35℃） 時菌落生長無顯著性差異。

圖2 菌落形態(tài)

圖3 鏈格孢菌分生孢子梗及分生孢子形態(tài)

表1 不同溫度對菌落直徑的影響

2.3 pH對菌落生長的影響

通過表2可以看出，隨pH增大，鏈格孢菌菌落直徑呈先增大后減小趨勢。當(dāng)pH為6時，菌落生長速度最快，平均直徑為9.0 cm；pH為7時，平均直徑7.1 cm；當(dāng)pH大于7時，菌落生長受到抑制；當(dāng)pH為9時，菌落直徑最小，為2.7 cm。對不同pH下菌落直徑方差分析的結(jié)果表明，不同的pH對鏈格孢菌菌落的生長有顯著影響。pH為6時，與其余各pH下的處理差異達(dá)極顯著水平；pH為5和pH為8的處理之間差異不顯著，均與pH為9的處理差異極顯著。

表2 不同pH對菌落直徑的影響

3 小結(jié)

1） 通過對白三葉草鏈格孢菌進(jìn)行分離，純化培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)、顏色、大小、生長速度，并在顯微鏡下觀察其分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征，鑒定該病原菌為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、鏈格孢屬真菌。這與李晶等人報道的結(jié)果相吻合［8］。

2）溫度、pH對菌落生長有一定的影響。在PDA培養(yǎng)基上，25℃處理下菌落生長最快，大于或小于25℃對菌落生長均有一定的抑制作用，故白三葉草鏈格孢菌生長的適溫為25℃。pH為6時，菌落生長速度最快，pH大于7或小于6對菌落生長均有一定的抑制作用，故白三葉草鏈格孢菌在弱酸性的環(huán)境下生長速度最快。

［1］ 王彩梅.白三葉草在現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代園藝，2013（3）：32-33.

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［9］ 楊曉平，胡紅菊，王友平，等.梨黑斑病病原菌的生物學(xué)特性及其致病性觀察［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009（12）：680-684.

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