毛永強，梁密，李寧，李娜

(遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧阜新，123000)

土霉素(oxytetracycline，OTC)是一種廣譜抗生素，在農(nóng)畜牧業(yè)上曾作為預(yù)防、治療畜禽疾病的動物藥物和促進畜禽生長的飼料添加劑而廣泛使用。但過量使用，在動物性食品中的土霉素殘留易通過食物鏈危害人體健康，因此許多國家已經(jīng)對食品中土霉素最大殘留限量做出規(guī)定［1-2］。現(xiàn)有土霉素殘留的檢測方法主要有紫外分光光度法［3］、熒光光度法［4］、液相色譜法［5］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［6］、化學(xué)發(fā)光法［7］、毛細管電泳法［8］、電化學(xué)傳感器［9］等，但上述方法儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜耗時，因此建立一種簡便、快速、靈敏的土霉素含量檢測方法對于保障人民身體健康具有重要意義。

量子點(quantum dots，QDs)是一種熒光納米材料，因其激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、顏色可調(diào)、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點引起研究者的廣泛關(guān)注，并以其作為熒光探針已用于致病菌［10］、生物毒素［11］、農(nóng)獸藥殘留［12-13］、非法添加劑［14］和重金屬［15］等食品分析檢測領(lǐng)域。內(nèi)濾效應(yīng)(Inner-filter effect，IFE)是在非共價偶聯(lián)熒光傳感體系中，因熒光體的激發(fā)光譜與吸收體的吸收光譜有相當(dāng)程度的重疊，而導(dǎo)致熒光體的熒光發(fā)射強度顯著降低。內(nèi)濾光效應(yīng)將吸光體的光吸收信號轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮殪`敏的熒光信號，從而提高檢測方法的靈敏度，已經(jīng)用于三聚氰胺、氰化物的定量檢測［16-17］。

本文通過水熱合成巰基乙酸修飾的CdTe量子點，發(fā)現(xiàn)土霉素的吸收光譜和CdTe量子點的熒光激發(fā)光譜有很大程度的重疊，基于土霉素和CdTe量子點之間的內(nèi)濾效應(yīng)，即土霉素吸收CdTe量子點發(fā)射的激發(fā)光能量，引起CdTe量子點的熒光強度顯著降低，且CdTe量子點的熒光猝滅強度與土霉素濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，建立一種測定土霉素含量的熒光分析法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

F-4500型熒光分光光度計，日立公司;UV-3010型紫外-可見分光光度計，日立公司;AUX320型電子分析天平，島津公司;pHS-3C型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

碲粉，硼氫化鈉(NaBH4)，巰基乙酸，氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，所用試劑均為分析純;土霉素，美國飛世爾科學(xué)世界公司;實驗用水為二次蒸餾水。

袋裝鮮牛奶樣品，購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 CdTe量子點的合成

采用水熱法合成巰基乙酸修飾的 CdTe量子點［18］。準(zhǔn)確稱取43 mg碲粉和80 mg NaBH4，加入5 mL蒸餾水溶解，在氮氣保護下，4℃冰浴中磁力攪拌反應(yīng)8 h，即生成NaHTe前驅(qū)體溶液。在250 mL三口燒瓶中加入0.142 7 g CdCl2，100 mL蒸餾水溶解后，逐滴加入107 μL巰基乙酸溶液，用1.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為11.0，通氮氣10 min后，磁力攪拌下注入新制備NaHTe溶液;繼續(xù)通氮氣，100℃油浴反應(yīng)2 h，得到實驗所需的水溶性CdTe量子點。合成的CdTe量子點溶液中加入無水乙醇，離心后收集沉淀，用去離子水將其重新溶解，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光測定

在5 mL比色管中，加入0.2 mL的CdTe量子點溶液、0.5 mL的Tris-HCl緩沖溶液(pH值6.5)和一定體積的土霉素標(biāo)準(zhǔn)液或提取液，蒸餾水定容到刻度并搖勻。室溫下放置5 min后，在激發(fā)波長330 nm條件下(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm)，分別測定加入土霉素溶液前后體系在激發(fā)波長520 nm處的熒光強度F0和F，計算體系的熒光猝滅值ΔF=F0-F。

2 結(jié)果與討論

2.1 土霉素與CdTe量子點之間的反應(yīng)機理

采用熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法，考察CdTe量子點的激發(fā)光譜和土霉素的紫外-可見吸收光譜(如圖1所示)。由圖1可以看出，在200～400 nm內(nèi)，CdTe量子點的激發(fā)光譜寬而連續(xù)，最大激發(fā)峰位于300 nm;而土霉素在275 nm和360 nm處強烈的吸收峰，且與CdTe量子點的激發(fā)光譜有較好地重疊，從而滿足二者發(fā)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)的條件。

圖1 CdTe量子點的熒光激發(fā)光譜(a)和土霉素的紫外-可見吸收光譜(b)Fig.1 Fluorescence excition spectrum of CdTe QDs(a)and absorption spectrum of OTC(b)

2.2 不同濃度土霉素對CdTe量子點熒光光譜的影響

在激發(fā)波長330 nm條件下，分別掃描加入土霉素溶液前后CdTe量子點的熒光光譜，進一步考察不同濃度土霉素對CdTe量子點熒光光譜的影響(如圖2所示)。由圖2可以看出，未加入土霉素時，CdTe量子點在520 nm處有最大熒光發(fā)射峰;隨著土霉素濃度的增加，CdTe量子點熒光強度逐漸降低，表明土霉素和CdTe量子點之間發(fā)生有效的內(nèi)濾效應(yīng)，即土霉素吸收CdTe量子點發(fā)射的激發(fā)光能量，而導(dǎo)致CdTe量子點的熒光強度顯著降低。因此可以利用土霉素調(diào)控CdTe量子點的熒光強度，從而建立一種熒光測定土霉素含量的新方法。

圖2 不同濃度土霉素存在下CdTe量子點的熒光光譜Fig.2 Fluorescence emission spectrum of CdTe

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1 pH值的影響

在不同pH值Tris-HCl緩沖溶液條件下，分別測定加入土霉素溶液前后CdTe量子點的熒光強度，考察Tris-HCl緩沖溶液pH值對體系熒光猝滅強度的影響(如圖3所示)。由圖3可以看出，在強酸性或強堿性的Tris-HCl緩沖溶液中，土霉素對CdTe量子點的熒光強度具有一般性猝滅，而當(dāng)pH值為6.5時，體系熒光猝滅值ΔF達到最大。因此試驗選擇Tris-HCl緩沖溶液pH值為6.5。

圖3 pH值對體系熒光猝滅強度的影響Fig.3 Effect of pH value on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

2.3.2 CdTe量子點濃度的影響

在5 mL比色管中，分別加入一定量的土霉素溶液和不同濃度的CdTe量子點溶液，作用一段時間后分別測定加入土霉素溶液前后CdTe量子點的熒光強度，考察CdTe量子點濃度對體系熒光猝滅強度的影響(如圖4所示)。由圖4可以看出，隨著CdTe量子點濃度的增加，體系熒光猝滅值ΔF逐漸增大，當(dāng)CdTe量子點濃度為5.0×10-6mol/L時ΔF達到最大值，但繼續(xù)增加CdTe量子點濃度，ΔF反而逐漸降低。選擇CdTe量子點濃度為5.0×10-6mol/L。

圖4 CdTe量子點濃度對體系熒光猝滅強度的影響Fig.4 Effect of CdTe concentration on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

2.3.3 反應(yīng)時間的影響

在5 mL比色管中，分別加土霉素溶液和CdTe量子點溶液，作用一段時間后分別測定加入土霉素溶液前后CdTe量子點的熒光強度，考察反應(yīng)時間對體系熒光猝滅強度的影響(如圖5所示)。由圖5可以看出，土霉素溶液加入CdTe量子點溶液5 min后，體系熒光猝滅值ΔF達到最大，且在隨后25 min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。因此選擇反應(yīng)時間為5 min。

圖5 反應(yīng)時間對熒光猝滅強度的影響Fig.5 Effect of time on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最佳實驗條件下，在5 mL比色管中加入一定量的CdTe量子點溶液和Tris-HCl緩沖溶液，同時加入不同濃度的土霉素溶液，反應(yīng)5 min后測定體系的熒光強度，以體系熒光猝滅值(ΔF)對土霉素濃度(c)作圖(如圖6所示)。由圖6可以看出，隨著土霉素濃度的增加，體系熒光猝滅值ΔF逐漸增大，且與土霉素濃度在2.0～20.0 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔF=6.082 73c-0.5，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，檢出限為0.05 μg/mL(按3SD/斜率計算，其中SD為11份空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。同時對10.0 μg/mL的土霉素溶液進行11次平行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve

2.5 干擾性實驗

當(dāng)土霉素濃度為10.0 μg/mL時，考察牛奶中常見物質(zhì)對土霉素含量測定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)相對誤差在 ±5.0% 內(nèi)，500 倍的K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cl-、NO3-、SO42-、PO43-和100倍的乳糖、蔗糖，對土霉素含量測定基本無影響，表明該方法具有較好的選擇性，可用于牛奶中土霉素含量的測定。

2.6 樣品中土霉素含量測定及回收率實驗

準(zhǔn)確量取1.0 mL牛奶樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL乙酸鹽緩沖液-乙腈混合溶液(體積比1∶4)，振蕩搖勻5 min，5 000 r/min 離心 20 min 除去蛋白質(zhì)。取上清液至分液漏斗中，加入5 mL正己烷，振蕩搖勻5 min，靜置分層后棄去正己烷層。吸取下層清液，用正已烷反復(fù)脫脂至澄清，溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后得待測液。

準(zhǔn)確吸取一定體積的樣品待測液，按照實驗方法測定其熒光強度，未檢出土霉素。為考察方法的可行性，同時進行加標(biāo)回收實驗。由表1可以看出，加標(biāo)回收率在97.4% ～103.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.4%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 土霉素在牛奶樣品中的回收率(n=6)Table 1 Recoveries of OTC in milk samples(n=6)

3 結(jié)論

從水熱合成巰基乙酸修飾的CdTe量子點中發(fā)現(xiàn)，土霉素吸收光譜和CdTe量子點的熒光激發(fā)光譜有較好地重疊，基于土霉素和CdTe量子點間的內(nèi)濾效應(yīng)，建立一種測定土霉素含量的熒光分析法。在優(yōu)化實驗條件下，CdTe量子點的熒光猝滅值與土霉素濃度在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，檢出限為0.05 μg/mL。該方法操作簡便、穩(wěn)定性好，能夠用于牛奶中土霉素含量的測定。

［1］ 徐桂連，代翠紅，馬鶯.土霉素完全抗原的制備與鑒定［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(4):192-196.

［2］ 陳輝華，王洪新，戴軍，等.土霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星在鯽魚體內(nèi)殘留及消除規(guī)律的初步研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(11):238-239.

［3］ 馮學(xué)忠，吳廣輝，方炳虎，等.紫外分光光度法測定長效土霉素注射液含量方法的建立［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2009，30(9):65-68.

［4］ 徐銘澤，廖秀芬，陶慧林，等.基于CdS@ZnS量子點與羅丹明B能量轉(zhuǎn)移熒光猝滅法檢測牛奶中土霉素［J］.分析測試學(xué)報，2013，32(10):1 217-1 221.

［5］ Lü Y K，WANG L M，YANG L，et al.Synthesis and application of molecularly imprinted poly(methacrylic acid)-silica hybrid composite material for selective solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography determination of oxytetracycline residues in milk［J］.Journal of Chromatography A，2012，1 227:48-53.

［6］ Delépée R，Maume D，Le Bizec B，et al.Preliminary assays to elucidate the structure of oxytetracycline’s degradation products in sediments:Determination of natural tetracyclines by high-performance liquid chromatography-fast atom bombardment mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2000，748(2):369-381.

［7］ 黃卉，印春生.靜態(tài)注射抑制化學(xué)發(fā)光法測定漁藥中的土霉素［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(11):302-304.

［8］ Maia P P，Amaya-Farfán J，Rath S，et al.Simultaneous determination of streptomycin and oxytetracycline in agricultural antimicrobials by CZE after an experimental design［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，43(2):450-456.

［9］ 陳志強，李建平，李玉平.高靈敏、易更新的土霉素分子印跡碳糊傳感器的研制［J］.分析化學(xué)，2011，39(7):1 009-1 014.

［10］ 劉曉紅，羅金平，田青，等.熒光量子點免疫標(biāo)記法檢測炭疽芽孢桿菌［J］.分析化學(xué)，2011，39(2):163-167.

［11］ 李園園，李培武，張奇，等.量子點標(biāo)記熒光免疫法檢測花生中黃曲霉毒素 B1［J］.中國油料作物學(xué)報，2012，34(4):438-442.

［12］ 黃珊，馬建強，肖琦，等.油溶性CdSe量子點熒光探針直接檢測農(nóng)藥水胺硫磷［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2013，33(10):2 853-2 857.

［13］ CHEN J X，XU F，JIANG H Y，et al.A novel quantum dot-based fluoroimmunoassay method for detection of enrofloxacin residue in chicken muscle tissue［J］.Food Chemistry，2009，113(4):1 197-1 201.

［14］ Afkhami A，Moosavi R，Madrakian T.Preconcentration and spectrophotometric determination of low concentrations of malachite green and leuco-malachite green in water samples by high performance solid phase extraction using maghemite nanoparticles.Talanta，2010，82(2):785-789.

［15］ HU X Y，ZHU K，GUO Q S，et al.Ligand displacementinduced fluorescence switch of quantum dots for ultrasensitive detection of cadmium ions［J］.Analytica Chimica Acta，2014，812:191-198.

［16］ ZHANG M W，CAO X Y，LI H K，et al.Sensitive fluorescent detection of melamine in raw milk based on the inner filter effect of Au nanoparticles on the fluorescence of CdTe quantum dots［J］.Food Chemistry，2012，135(3):1 894-1 900.

［17］ ZHAI Y M，JIN L H，WANG P，et al.Dual-functional Au-Fe3O4dumbbell nanoparticles for sensitive and selective turn-on fluorescent detection of cyanide based on the inner filter effect［J］.Chemical Communications，2011，47(29):8 268-8 270.

［18］ GE S H，LU J J，GE L，et al.Development of a novel deltamethrin sensor based on molecularly imprinted silica nanospheres embedded CdTe quantum dots［J］.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2011，79(5):1 704-1 709.