李丹丹，徐義剛，王昱，邱索平，高會江，高慎陽

1(海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，海南?？冢?70311)

2(黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，黑龍江哈爾濱，150001)

3(重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶，404100)

4(從化出入境檢驗檢疫局，廣東廣州，510900)5(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，牛遺傳育種研究室，北京，10019)6(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州，121001)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，在海水養(yǎng)殖的牡蠣、蝦和蟹等貝類、甲殼類水生動物中分布廣泛，是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一［1］，人類進食被VP污染的食品會引起急性胃腸炎，嚴重者還可引起敗血癥［2-3］，是國際公認的食物中毒病原菌，其引發(fā)的食源性疾病已成為當(dāng)前全球面臨的公共衛(wèi)生問題之一［4］。近年來，我國沿海地區(qū)常發(fā)生由該致病菌感染引發(fā)的食源性中毒事件，該菌也是我國進出口水產(chǎn)品檢測的主要檢測項目之一［5-6］。目前，對VP的檢測以傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定為主。傳統(tǒng)的細菌鑒定方法特異性差、靈敏度低并且耗時長、操作繁瑣、受環(huán)境及主觀因素影響大。

雙啟動寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide，DPO)設(shè)計簡單，不需要對退火溫度進行優(yōu)化及對引物進行篩選，簡化了常規(guī)PCR方法引物設(shè)計的步驟［7-10］;另外，由于DPO引物結(jié)構(gòu)特殊，該引物要比常規(guī)PCR引物的特異性更強，堿基錯配發(fā)生3個或以上，擴增就會停止［11-12］，所以檢測結(jié)果要比常規(guī)PCR方法更為精確。本研究利用該技術(shù)，建立了VP DPO-PCR快速檢測方法，為有效檢測VP提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及臨床樣品

空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希菌O157:H7、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、變形桿菌、阪崎腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、腸侵襲性大腸桿菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌等標(biāo)準菌株購自美國典型菌種保藏中心;副溶血弧菌分離株由本中心實驗室分離保存。550份水產(chǎn)品來自于水產(chǎn)品養(yǎng)殖場和水產(chǎn)品流通市場，包括蝦、蟹、海水、蟶子、鮑魚、海魚、蛤蜊、泥螺、花蛤、海虹、海瓜子和象拔蚌等水產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑

細菌培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基BPW，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;細菌基因組DNA抽提試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2，購自寶生物工程大連有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank公布的VPtoxR基因序列(AB029915.1)中的保守序列，設(shè)計常規(guī)引物和DPO引物各一對，擴增片段大小均為349bp，兩對引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

常規(guī)引物基因序列:

VP-CGF 5＇-ATCGTAGAGCCGTCTTTAGCGACGACTTCTGACGCA-3＇

VP-CGR 5＇-GGTTATTTTGTCCGCCAGTGGCAATTACTTCCACTG-3＇

DPO引物基因序列:

VP-DPOF 5＇-ATCGTAGAGCCGTCTTTAGCGACIIIIICTGACGCA-3＇

VP-DPOR 5＇-GGTTATTTTGTCCGCCAGTGGCIIIIICTTCCACTG-3＇

1.2.2 DNA模板的制備

1.1.1節(jié)中的菌株分別接種到5 mL增菌培養(yǎng)基BPW中，培養(yǎng)12 h后，取1 mL菌液按照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。臨床樣品的檢測采用煮沸法提取細菌DNA。

1.2.3 DPO-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及電泳分析

對DPO-PCR反應(yīng)體系中的各項反應(yīng)參數(shù)和循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化，篩選出DPO-PCR反應(yīng)中最佳反應(yīng)模式。

1.2.4 DPO-PCR退火溫度不敏感性檢測

將退火溫度范圍設(shè)為49～69℃，進行DPO-PCR和常規(guī)PCR擴增實驗，產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 DPO-PCR特異性檢測

利用建立的VP DPO-PCR檢測方法對1.1.1節(jié)中的菌株進行擴增，產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，驗證方法的特異性。

1.2.6 DPO-PCR靈敏性檢測

提取VP基因組DNA并測定濃度，10倍倍比稀釋DNA，原液至10-1～10-6，根據(jù)試劑盒提取每級稀釋度細菌 DNA，各取2 μL作為模板進行 DPO-PCR擴增。

1.2.7 DPO-PCR檢測方法的初步應(yīng)用

將采集來的550份水產(chǎn)品(40份蝦、20份蟹、65份海水、70份蟶子、15份鮑魚、15份海魚、75份蛤蜊、30份泥螺、50份花蛤、85份海虹、75份海瓜子、10份象拔蚌)經(jīng)過處理勻漿后，均用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h，增菌液煮沸法提取DNA并進行DPO-PCR擴增，所得檢測結(jié)果用行業(yè)標(biāo)準法(SN/T 1870-2007)進行復(fù)檢，以驗證所建立的VP DPO-PCR檢測方法的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 VP DPO-PCR檢測方法的確定

通過對DPO-PCR反應(yīng)體系中各項反應(yīng)參數(shù)和循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化，最終確定了VP最佳DPO-PCR反應(yīng)模式。在20 μL反應(yīng)體系中含有:10×PCR緩沖液2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL，dNTP 混合物(2.5 mmol/L)2.0 μL，引物各 0.2 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA 模板 2 μL，去離子水補充至 20 μL。反應(yīng)程序:95℃ 3 min;94℃ 1min，58℃ 50 s，72℃50 s，25個循環(huán);72℃ 10 min。對瓊脂糖凝膠電泳分析獲得了約349 bp的目的片段(圖1)。通過基因測序，結(jié)果顯示已成功擴增出目的基因。

圖1 VP toxR基因DPO-PCR擴增結(jié)果Fig.1 DPO-PCR products of VP toxR gene

2.2 DPO-PCR退火溫度不敏感性

退火溫度設(shè)定在49～69℃，由圖2-B可以看出，DPO-PCR均能有效擴增出VP toxR基因，說明DPO-PCR退火溫度范圍較寬并且對退火溫度不敏感，而常規(guī)PCR擴增效果較差，存在最佳的退火溫度(圖2-A)。

圖2 退火溫度對PCR擴增的影響Fig.2 Effect of annealing temperature on PCR amplification

2.3 DPO-PCR方法特異性擴增結(jié)果

利用建立的DPO-PCR檢測方法對1.1.1節(jié)中的菌株進行擴增，結(jié)果顯示:以toxR基因為靶基因進行擴增，只有VP及其分離株擴增出349bp特異性條帶，其它菌株均未出現(xiàn)任何擴增條帶(圖3)，表明所建立的VP DPO-PCR檢測方法特異性強。

圖3 VP DPO-PCR特異性實驗檢測結(jié)果Fig.3 Specificity of DPO-PCR detection of VP

2.4 DPO-PCR方法檢測靈敏度

10倍系列稀釋菌液按試劑盒提取每級稀釋度細菌DNA，按2.1優(yōu)化出的DPO-PCR反應(yīng)條件進行檢測，結(jié)果表明在20 μL反應(yīng)體系中，模板DNA加入2 μL，菌體濃度自1.21×107CFU/mL至1.21×102CFU/mL均可擴增出清晰條帶，菌體濃度為1.21×101未擴增出條帶(圖4)，表明本實驗建立的 DPOPCR方法檢測VP靈敏度為1.21×102CFU/mL。

圖4 VP菌液稀釋法DPO-PCR敏感度檢測結(jié)果Fig.4 Sensitivity of DPO-PCR for detection of VP dilution

2.5 DPO-PCR檢測臨床樣品的實驗結(jié)果

利用建立的VP DPO-PCR檢測方法對550份樣本進行了檢測，檢出19份VP陽性樣本，所得檢測結(jié)果經(jīng)行業(yè)標(biāo)準法(SN/T 1870-2007)進行復(fù)檢，2種方法檢測結(jié)果的一致率為100%(見表1)，顯示該方法具有很好的可靠性。

表1 應(yīng)用DPO-PCR檢測結(jié)果Table 1 Applications DPO-PCR test results

3 討論

目前，包括我國在內(nèi)的絕大多數(shù)國家針對食源性致病菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)細菌分離鑒定的方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進行鑒定。傳統(tǒng)檢測方法存在檢測效率低、靈敏度低且耗時長、操作繁瑣等不足。通常情況下，鑒定一種細菌需要5～7 d，而針對一些生化特性復(fù)雜的細菌，如單增李斯特氏菌的檢測周期可長達20 d之久，嚴重影響了檢測鑒定的周期，很難適應(yīng)現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要［13］。PCR技術(shù)具有快速、特異性強和靈敏度高等特點，是目前食源性致病菌檢測主要采用的檢測技術(shù)之一。在此基礎(chǔ)之上，又相繼發(fā)展了DNA探針技術(shù)、實時熒光PCR技術(shù)以及PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)等，雖然能夠滿足快速檢測的需求，但是對引物設(shè)計的要求很高，不僅需要對引物進行篩選，而且需要優(yōu)化退火溫度，增加了實驗操作步驟，費時又費力。在本研究中，引入了新型的DPO引物設(shè)計方法，建立了VP DPO-PCR檢測方法。

在本研究DPO-PCR退火溫度不敏感性實驗中，實驗結(jié)果顯示，退火溫度設(shè)定在49～69℃，DPO-PCR均能有效擴增出目標(biāo)基因，說明DPO-PCR退火溫度范圍較寬并且對退火溫度不敏感，而常規(guī)PCR擴增結(jié)果則受退火溫度變化的影響較大，擴增效果相對較差;在DPO-PCR特異性實驗中顯示，建立的 DPOPCR能夠準確地擴增出目標(biāo)菌，其他菌株均未出現(xiàn)任何擴增條帶，表明所建立的VP DPO-PCR檢測方法特異性強。臨床樣品檢測結(jié)果表明，利用建立的VP DPO-PCR檢測方法能夠?qū)嶋H樣品中的VP進行準確檢測，與行標(biāo)法(SN/T 1870—2007)的檢測結(jié)果一致，具有良好的實用性。

本研究建立的DPO-PCR檢測方法，DPO引物設(shè)計簡單，簡化了常規(guī)PCR引物設(shè)計步驟，提高了檢測效率;并且由于DPO引物結(jié)構(gòu)特殊具有比常規(guī)PCR引物更強的特異性，其檢測結(jié)果要比常規(guī)PCR的檢測結(jié)果更為準確，DPO-PCR檢測方法的建立為VP快速精準的檢測提供了新方法、新手段。

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