王軍，王忠合，傅力，盧彬

1(韓山師范學院生命科學與食品科技學院，廣東潮州，521041)

2(新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊，830052)

金帶細鲹(Selaroides leptolepis)為鲹科細鲹屬的魚類，俗名木葉鲹，為近海暖水性魚類，產(chǎn)于南海、臺灣海峽。其富含蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素，營養(yǎng)價值較高［1］。

糖基化是近年來食品蛋白質(zhì)改性中的一種很有前途的方法，可以充分利用蛋白質(zhì)的表面性能(空氣/水或油/水界面的吸附能力)與還原糖較好的持水、增稠性能，改善蛋白質(zhì)或多肽的抗氧化性、溶解性、乳化性和質(zhì)構(gòu)等方面的改性［1-2］。但是美拉德類糖基化反應也有很多的不足，如產(chǎn)生有毒和致畸化合物、褐變、營養(yǎng)丟失及反應時間長等［3-5］。本文以金帶細鲹魚肉蛋白酶解物為原料，研究了不同溫度(100、120℃)下美拉德修飾反應對酶解物功能特性及5-羥甲基糠醛和丙烯酰胺等潛在危害物形成的影響，以期為魚肉蛋白酶解物的修飾與安全控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金帶細鲹:購于當?shù)厥袌觯コ~頭和內(nèi)臟，洗凈瀝干后用攪碎機攪成肉糜，用保鮮袋分裝(每袋100 g)后，貯存于-20℃冰箱備用;大豆色拉油，購于當?shù)爻?胰蛋白酶(4 000 U/g)，廣東恒凱生物試劑有限公司;胃蛋白酶(3000～3 500 NFU/mg)、胰酶(5×USP)、亞硝基鐵氰化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)，生工生物工程(上海)有限公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)、丙烯酰胺、5-羥甲基糠醛、甲酸、甲醇、L-亮氨酸，美國Sigma公司;葡萄糖、三氯乙酸、鐵氰化鉀、FeCl3、FeCl2、乙醇、水楊酸鈉、NaClO、H3PO4等。

UV-2800型紫外可見分光光度計，尤尼科(上海)儀器有限公司;FD-1D-50型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;2-16 P型離心機，美國Sigma公司;PHSJ-4A型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司;DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器，天津予華儀器有限公司;DE-100LB型高剪切分散乳化機，南通克萊爾混合設備有限公司;Waters Sep-pak C18固相萃取柱，沃特世科技(上海)有限公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent 1200型UV/Visible檢測器、Eclipse XDB-C18型色譜柱，均為安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚肉蛋白酶解物的制備

取魚糜按質(zhì)量比1∶3與水混合后，調(diào)節(jié)溶液pH和溫度至胰蛋白酶的最適條件(pH為7.0，溫度為50℃)，加入1%的胰蛋白酶(E/S=1∶100)酶解30 min后取樣，100℃滅酶10 min，將酶解液于10 000 r/min下離心10 min，取上清液冷凍干燥，備用。采用TNBS法［6］測得魚肉蛋白酶解物的水解度為10.8%。

1.2.2 酶解物美拉德反應產(chǎn)物的制備

將酶解物用蒸餾水配制成濃度為25 mg/mL的溶液，按酶解物與葡萄糖質(zhì)量比1∶2加入葡萄糖，再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，取20 mL置于具塞密閉試管中，分別在100 ℃，120 ℃下反應0、1、2、3、4、5、6 h(MRPs-100、MRPs-120 分別表示 100、120 ℃下的反應產(chǎn)物)。反應后，立即取出置于冰水浴中冷卻至室溫，測定pH值，然后置于-18℃冷凍備用。同時按上述試驗條件，以不加葡萄糖的作為對照(對照-100、對照-120分別表示在100、120℃下的反應產(chǎn)物)。

1.2.3 美拉德反應進程分析

A294和A420:反應樣液用蒸餾水稀釋100倍和50倍，以蒸餾水做參比，分別在294 nm和420 nm下測定吸光度［7］。

游離氨基含量的測定:采用TNBS法［6］。

1.2.4 美拉德反應潛在危害物的測定

5-羥甲基糠醛(HMF):根據(jù) Rufián-Henares［8］的方法，略作修改。將樣品過0.45 μm濾膜后，用高效液相色譜法測量，色譜條件:Agilent Eclipse XDB-C18型色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫 30 ℃，流動相為90%水+10%甲醇，流速為1.0 mL/min，檢測波長280 nm，進樣體積20 μL。使用外標法繪制標準曲線，質(zhì)量濃度梯度為:9.94、29.83、49.72、69.61、89.50 μg/mL。以峰面積(y)和5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度(x)作標準曲線，標準曲線方程為:y=0.079 5x+0.021 5，R2=0.999 7。色譜圖如圖1所示。

圖1 5-羥甲基糠醛(HMF)的標準液質(zhì)色譜圖Fig.1 LC-MS chromatograms for determination of 5-hydroxymethylfurfural(HMF)

丙烯酰胺(AA):根據(jù)文獻［9］的方法，略作修改。取1 mL樣液以1滴/s加入固相萃取柱(使用前依次用1 mL甲醇和1 mL水活化)中，收集除第1滴外的流出液，用氮氣吹干后再用1 mL水溶解，過0.45 μm濾膜后用高效液相色譜系統(tǒng)測定含量。色譜條件:Agilent 1200型高效液相系統(tǒng)，Agilent Eclipse XDB-C18型色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫20 ℃，流動相為水-甲醇(體積比90∶10)，流速為1.0 mL/min，檢測波長210 nm，進樣體積15 μL。質(zhì)譜條件:陽離子電噴霧電離源(ESI+)，質(zhì)譜掃描方式為多反應監(jiān)測(Multiple Reaction Monitor，MRM)方式，毛細管電壓1.0 kV，錐孔電壓20 V;離子源溫度110℃;射頻透鏡1(RF Lens 1)的電壓為30.8 V;脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流量600 L/h;錐孔氣流量50 L/h;碰撞室入口電壓2.0 V，出口電壓3 V;碰撞能量20 eV;碰撞腔真空度2.2×10-3Torr。監(jiān)測離子為AA母離子m/z 71.7，子離子 m/z 54.8;定量離子為 AA m/z 54.8。以峰面積(y)與丙烯酰胺的質(zhì)量濃度(x)作標準曲線，標準曲線方程為:y=0.122 5x+0.283 3，R2=0.995 2。以保留時間和各對離子的響應強度的比例作為定性標準。其液質(zhì)色譜圖見圖2。

圖2 丙烯酰胺液質(zhì)色譜圖Fig.2 LC-MS chromatograms for determination of acrylamide

1.2.5 功能特性分析

溶解性:取0.2 g樣品與20 mL蒸餾水混合，用1.0 mol/L的NaOH溶液或1.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在30 ℃水浴下攪拌30 min(攪拌過程中測定并保持pH)，于6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法［10］測定上清液中蛋白質(zhì)的含量，根據(jù)總蛋白的含量計算蛋白質(zhì)的溶解性，結(jié)果表示為上清液中蛋白濃度占相應的總蛋白濃度的百分比。

乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定:采用經(jīng)典的比濁法［11］測定乳化特性。取0.018 g樣品與1.8 mL去離子水混合，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將pH 調(diào)為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。加入 0.6 mL大豆色拉油，經(jīng)高速攪拌器于10 000 r/min下處理1 min，分別在攪拌后0 min和10 min時從測試管底部取樣50 μL，與5.0 mL 0.1%SDS溶液混勻，在波長500 nm處測定吸光度，以0.1%SDS溶液作空白。乳化性指數(shù)(EAI，m2/g)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI，min)的計算公式［11］如下:

式中:DF，稀釋倍數(shù)，DF=100;C，樣品質(zhì)量濃度，g/mL;φ，光程，φ =1 cm;θ，乳液中油相所占比例，θ=0.25;A0，0 min 時測定的吸光度;A10，10 min 時測定的吸光度。

體外消化性:取反應3 h的樣液20 mL，用0.02 mol/L HCl調(diào)至pH 2.0，加入1 mL胃蛋白酶液(E/S=1/250)，37℃水浴中體外模擬胃液消化處理2 h，取樣采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法［10］測定蛋白質(zhì)的含量;其余部分用1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至7.0，裝入透析袋(截留分子質(zhì)量10 ku)中，再加入1 mL胰酶(E/S=1/50)，將其置于裝有100 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中進行體外模擬腸液消化2 h，每隔0.5 h收集消化產(chǎn)物，采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法［10］測定蛋白質(zhì)的含量，按公式(3)［12］計算樣品的體外消化率DR。

式中:S為上清液中的蛋白質(zhì)含量，μg;T為樣品中的蛋白質(zhì)總量，μg。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗重復測定3次，結(jié)果表示為平均值±標準偏差SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件進行一維方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著性采用Duncan(鄧肯)檢驗，檢驗水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應進程分析

2.1.1 pH值的變化

由圖3可知，反應體系MRPs-100和MRPs-120的pH值隨著反應時間的延長而逐漸降低，且MRPs-120的pH值在前4 h急劇降低，4 h后pH值下降趨于平緩。pH值的降低主要是因為美拉德反應過程中糖和酶解物受熱發(fā)生降解生成甲酸和乙酸等酸性物質(zhì)，以及反應消耗了氨基酸等物質(zhì)［13］。而對照組的pH值無顯著變化(P＞0.05)。

圖3 反應體系pH的變化Fig.3 Change of pH value in reaction system

2.1.2 A294nm和A420nm的變化

294 nm和420 nm處的吸光度值分別是美拉德反應中間階段和高級階段的評定指標之一，酶解物與葡萄糖的反應體系中A294nm和A420nm隨溫度和時間的變化如圖4所示。

圖4 反應體系A294(a)和A420(b)的變化Fig.4 Change of A294(a)and A420(b)in reaction system

由圖4可知，隨著反應時間的增加MRPs-120和MRPs-100兩體系的 A294nm和 A420nm顯著增加，且MRPs-120的吸光度增加趨勢遠高于MRPs-100的吸光度增加趨勢(P＜0.05)，此結(jié)果與 Yilmaz等［14］的研究結(jié)果一致，這表明反應溫度對體系色澤的影響較大。兩個對照組的A294nm無明顯變化，而A420nm略有升高，這可能是由于魚肉酶解物中含有少量的還原糖，加熱導致還原糖的焦糖化反應或者糖與肽之間的美拉德反應而形成有色物質(zhì)。

2.1.3 游離氨基的變化

由圖5可知，反應最初2 h游離氨基的含量迅速下降，2 h后游離氨基的含量變化不顯著(P＞0.05)，反應2 h時MRPs-120的游離氨基的損失速率是MRPs-100的2.88倍。在美拉德反應的初期階段，肽類或者蛋白質(zhì)的α-氨基和賴氨酸殘基的ε-氨基與葡萄糖的羰基發(fā)生反應，造成這些高活性游離氨基大量減少，而其他氨基難以被利用，因而加熱處理后期游離氨基含量變化不明顯［15］。同時，美拉德反應會降低反應體系的pH值，pH下降反而會降低反應底物的反應活性［13］，因而反應進行到一定階段時，參與美拉德反應的游離氨基數(shù)減少。而對照組中游離氨基的含量無顯著變化(P＞0.05)。

圖5 反應體系中游離氨基含量的變化Fig.5 Change of content of free amino group in reaction system

2.2 功能特性分析

2.2.1 溶解性的變化

由圖6可知，魚肉酶解物經(jīng)美拉德反應修飾后其溶解度顯著增加(P＜0.05)，而對照組樣品的溶解度變化不大，這可能是因為酶解物與親水性的葡萄糖結(jié)合引入了具有親水性的羥基，改善了樣品與水分子之間的親和力，從而提高了反應產(chǎn)物的溶解度［16］。同時，MRPs-120的溶解度顯著高于相同條件下MRPs-100的溶解度，MRPs-120的溶解度最高達到97.95%，這說明一定程度的加熱處理有助于提高酶解物的溶解度。

圖6 美拉德反應對酶解物溶解度的影響Fig.6 Effect of Maillard reaction on solubility of hydrolysates

2.2.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性的變化

如圖7所示，在實驗的pH范圍內(nèi)所有樣品具有較好的乳化活性，且MRPs的乳化活性比各對照組的乳化活性顯著提高(P＜0.05)，MRPs-120的乳化活性最高，達到361 m2/g。由于葡萄糖具有親水性，與酶解物糖基化后，使其產(chǎn)物的表面活性增大，從而提高了MRPs的乳化活性。糖基化反應在一定程度上可提高酶解物的乳化穩(wěn)定性，而加熱處理影響樣品乳化穩(wěn)定性的變化規(guī)律不明顯，短時間的熱處理可提高酶解物的乳化穩(wěn)定性，但是長時間的熱處理又不利于其乳化穩(wěn)定性，這說明酶解物樣品形成乳化分散體系的能力方面和穩(wěn)定乳化分散體系方面不存在相關性。

圖7 美拉德反應對酶解物的乳化性(a)及乳化穩(wěn)定性(b)的影響Fig.7 Effect of temperature and pH on emulsifying activity index(a)and emulsion stability index(b)MRPs and hydrolysates

2.2.3 體外消化性的變化

從圖8可知，在0～120 min模擬胃液消化階段，所有樣品的體外消化速度較快，對照-120的體外消化率均高于其他樣品，這可能是由于經(jīng)120℃熱處理導致蛋白質(zhì)或肽分子解鏈胃蛋白酶作用位點暴露，體外消化率隨之提高。而糖基化產(chǎn)物在模擬胃液中的消化水解程度較小，這主要是由于胃蛋白酶屬于肽鏈內(nèi)切酶，其專一性程度較大，主要作用于芳香族氨基酸的羧基基團形成的肽鍵［12］，而無法降解糖基化接枝反應形成的修飾產(chǎn)物。在120～240 min模擬腸液消化階段，酶解物及其美拉德反應修飾產(chǎn)物在胰酶作用下的消化率逐漸增加，其中對照-120酶解物的體外消化率仍高于其他樣品，在240 min時體外消化率達到了89.29%。美拉德反應產(chǎn)物在模擬腸液中的消化速率降低，也可能是由于美拉德反應產(chǎn)物抑制了消化酶的活力而降低了消化性［17］。

圖8 美拉德反應對酶解物體外消化性的影響Fig.8 Effect of Maillard reaction on in vitro digestibility of hydrolysates

2.3 美拉德反應潛在危害物的變化

2.3.1 5-羥甲基糠醛(HMF)的變化

5-羥甲基糠醛(HMF)是美拉德反應的中間產(chǎn)物之一，常用于評價美拉德反應進行的程度，主要是在食品加熱的過程中由糖類物質(zhì)直接脫水形成，除了溫度條件外HMF的形成還取決于食品中糖的種類、pH值、水分活度和媒介物二價陽離子的濃度等因素的作用［17］。由表1可知，隨著反應時間的延長，MRPs-120中HMF含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，反應6 h時HMF含量達到了32.94 μg/mL，是 MRPs-100的 82倍，而MRPs-100僅在反應6 h時檢測到微量的HMF存在。隨著反應時間的延長，對照-120中HMF的含量也呈現(xiàn)略微增加的趨勢，在反應6 h時含量為0.94 μg/mL，這可能是因為酶解物中含有少量糖脫水形成。對照-100在整個反應過程中未檢測出HMF存在，這表明反應溫度是反應過程中形成HMF的關鍵因素，這與Ajandouz等人研究發(fā)現(xiàn)的焦糖化反應在較高的反應溫度或堿性pH條件下容易發(fā)生的結(jié)論一致［13］。

表1 美拉德反應對HMF含量的影響 單位:μg/mLTable 1 Effect of Maillard reaction on HMF content

2.3.2 丙烯酰胺的變化

如表2所示，隨著反應時間的延長，MRPs-100中丙烯酰胺含量隨著反應時間的延長而逐漸增加，反應6 h后達到10.64 μg/mL;MRPs-120中丙烯酰胺的含量呈先增加后趨緩的趨勢，這可能是由于形成的丙烯酰胺進一步參與了反應而降解;對照-120和對照-100中測出含有微量的丙烯酰胺，且隨著反應時間的延長其含量逐漸積累。丙烯酰胺是一種具有神經(jīng)毒性的小分子化合物，在食品加工過程中主要由天冬酰胺通過美拉德反應形成，對人類健康具有潛在的危害性，因而在采用美拉德反應修飾蛋白酶解物的過程中要盡量避免不必要的長時間高溫加熱，以減少丙烯酰胺的形成。

表2 美拉德反應對丙烯酰胺含量的影響 單位:μg/mLTable 2 Effect of Maillard reaction on acrylamide content

3 結(jié)論

(1)美拉德反應的過程中，A294nm、A420nm急劇增加，MRPs-120的pH值和游離氨基的含量與MRPs-100相比顯著降低(P＜0.05)，而對照組無顯著變化(P ＞0.05)。

(2)功能特性研究表明，與未糖基化的酶解物相比，美拉德修飾反應提高了其溶解度、乳化活性及乳化穩(wěn)定性，而體外消化率顯著降低。

(3)隨著反應時間的延長，MRPs中HMF和丙烯酰胺的含量逐漸增大，而對照-100中未檢出HMF的存在。

［1］ Lam R S，Nickerson M T.Food proteins:a review on their emulsifying properties using a structure-function approach［J］.Food Chemistry，2013，141(2):975-984.

［2］ Oliver C M，Melton L D，Stanley R A.Creating proteins with novel functionality via the Maillard reaction:A review［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2006，46(4):337-350.

［3］ Poulsen M W，Hedegaard R V，Andersen J M，et al.Advanced glycation endproducts in food and their effects on health［J］.Food and Chemical Toxicology，2013，60(10):10-37.

［4］ Erbersdobler HF，Somoza V.Forty years of furosine-Forty years of using Maillard reaction products as indicators of the nutritional quality of foods［J］.Molecular Nutrition ＆Food Research，2007，51(4):423-430.

［5］ JIANG Z，WANG L，WU W，et al.Biological activities and physicochemical properties of Maillard reaction products in sugar-bovine casein peptide model systems［J］.Food Chemistry，2013，141(4):3 837-3 845.

［6］ 王軍，王忠合，宋鳳艷，等.糖基化反應對雞蛋清蛋白與低聚麥芽糖交聯(lián)物活性和功能性的影響［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30(10):22-29，95.

［7］ GU FL，Kim J M，Hayat K，et al.Characteristics and antioxidant activity of ultrafiltrated Maillard reaction products from a casein-glucose model system［J］.Food Chemistry，2009，117(1):48-54.

［8］ Rufián-Henares JA，Delgado-Andrade C.Effect of digestive process on Maillard reaction indexes and antioxidant properties of breakfast cereals［J］.Food Research International，2009，42(3):394-400.

［9］ 趙榕，邵兵，趙婕，等.液相色譜-電噴霧質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定高溫烹制的淀粉類食品中的丙烯酰胺［J］.色譜，2005，23(3):289-291.

［10］ Choi S J，Kim H J，Park K H，et al.Molecular characteristics of ovalbumin-dextran conjugates formed through the Maillard reaction［J］.Food Chemistry，2005，92(1):93-99.

［11］ Thiansilakul Y，Benjakul S，Shahidi F.Functional properties and antioxidative activity of protein hydrolysates prepared from round scad(Decapterus maruadsi)［J］.Food Chemistry，2007，103(4):1 385-1 394.

［12］ ZHENG L，REN J，SU G，et al.Comparison of in vitro digestion characteristics and antioxidant activity of hot-and cold-pressed peanut meals［J］.Food Chemistry，2013，141(4):4 246-4 252.

［13］ Ajandouz E H，Desseaux V，Tazi S，et al.Effects of temperature and pH on the kinetics of caramelisation，protein cross-linking and Maillard reactions in aqueous model systems［J］.Food Chemistry，2008，107(3):1 244-1 252.

［14］ Yilmaz Y，Toledo R.Antioxidant activity of water-soluble Maillard reaction products［J］.Food Chemistry，2005，93(2):273-278.

［15］ Dong S Y，Panya A，Zeng M Y，et al.Characteristics and antioxidant activity of hydrolyzed β-lactoglobulin-glucose Maillard reaction products［J］.Food Research International，2012，46(1):55-61.

［16］ Martinez-Alvarenga M S，Martinez-Rodriguez E Y，Garcia-Amezquita L E，et al.Effect of Maillard reaction conditions on the degree of glycation and functional properties of whey protein isolate-Maltodextrin conjugates［J］.Food Hydrocolloids，2014，38(7):110-118.

［17］ Corzo-Martínez M，Hernandez-Hernandez O，Villamiel M，et al.In vitro bifidogenic effect of Maillard-type milk protein-galactose conjugates on the human intestinal microbiota［J］.International Dairy Journal，2013，31(2):127-131.

［18］ Capuano E，F(xiàn)ogliano V.Acrylamide and 5-hydroxymethylfurfural(HMF):A review on metabolism，toxicity，occurrence in food and mitigation strategies［J］.LWT-Food Science and Technology，2011，44(4):793-810.