張燁華 ，王立民 ，王聰慧 ，趙興旺 ，丁新平 ，周平

（1石河子大學動物科技學院，石河子 832003；2新疆兵團綿羊繁育生物技術重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學院基因工程實驗室，石河子832000；3石河子市石總場畜牧獸醫(yī)服務中心，石河子，832000;4新疆西部牧業(yè)股份有限公司紫泥泉種羊場,石河子 832000）

微衛(wèi)星（Microsatellites），也稱為簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSRs）或短串聯(lián)重復序列(Short Tandem Repeats，STRs），其作為一種分子標記現(xiàn)已被廣泛的應用于遺傳學、親緣關系、種群以及其他方面的研究。微衛(wèi)星首先由Miesfeld等[1]于1981年在人類基因文庫中發(fā)現(xiàn)，隨后這種簡單重復序列被Tautz等[2]證實廣泛存在于真核生物中。與其他分子標記技術相比較，微衛(wèi)星標記擁有明顯優(yōu)點[3]，如符合孟德爾遺傳規(guī)律、共顯性遺傳、遺傳性穩(wěn)定、多態(tài)性豐富等。國內(nèi)外的研究進展表明，微衛(wèi)星標記現(xiàn)已被廣泛地應用于多物種多層次的檢測及分析，如蚌類、魚類；肉品質(zhì)分析、植物生態(tài)學和進化、綿羊群體多態(tài)性、牛親子鑒定、家兔品種的遺傳變異等[4-9]。

新疆是我國綿羊品種最多、遺傳品質(zhì)最復雜的省區(qū)，在長期生產(chǎn)實踐中育成了許多具有特色的地方品種[9]。藏羊[10]是中國綿羊三大系之一，具有耐寒、耐粗放飼養(yǎng)、抗病力強等優(yōu)良種質(zhì)特性，主要分布在青藏高原及其毗鄰的川、滇、甘等高寒地區(qū)，是具有青藏高原特色的品種資源。目前，有關藏羊遺傳多樣性方面的研究文獻較少，楊燕等[11]對部分藏系綿羊研究，認為藏系綿羊各群體間親緣關系及系統(tǒng)進化有待進一步研究。徐琳娜等[10]在藏系綿羊遺傳多樣性的研究進展中表明，有關藏系綿羊遺傳特性的系統(tǒng)研究很少，需要進一步了解。李祥龍等[12]利用微衛(wèi)星技術研究我國蒙古羊、烏珠穆沁羊、哈薩克羊、阿勒泰羊、灘羊和藏綿羊6個地方綿羊品種的研究。

本研究以新疆的地方綿羊品種（策勒黑羊、多浪羊、巴音布魯克羊、巴什拜羊及阿勒泰羊）和藏羊為研究對象，探討各品種綿羊的遺傳多樣性，旨在為品種資源保護、遺傳育種工作提供參考依據(jù)；其次，研究藏羊與新疆品種之間的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生樹對于品種的起源進化研究、種質(zhì)資源保護以及科學開發(fā)利用均具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗樣本包括6個綿羊群體，均來自新疆南疆地區(qū)，共計263只，每個群體隨機采集約45只，均采用頸靜脈采血，所采血樣均為5 mL/只，EDTA抗凝，-20℃保存，用于DNA提取。各群體的樣本數(shù)量見表1。

表1 6個綿羊品種信息Tab.1 Information of 6 sheep breeds

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及引物合成

1）DNA的提取：用天根的血液基因組DNA提取試劑盒提取;

2）根據(jù)相關文獻[13]及 Genbank提供的信息先擇8個座位的引物，交由生工生物工程（上海）有限公司采用HAP方法合成。引物信息見表2。

3）PCR擴增反應：95℃預變性4 min；94℃變性 30 s，53-62.8℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共33-40個循環(huán)；72℃充分延伸10 min。4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

表2 8對微衛(wèi)星引物的詳細信息Tab.2 Detailed information of 8 pairs of SSRs primers

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星等位基因數(shù)據(jù)分析軟件為Quantity One 4.6.2，用其分析所分離的微衛(wèi)星片段大??；采用Excel Microsatellite Toolkit計算等位基因頻率和等位基因大小范圍；計算多態(tài)信息含量（Polymorphic information content，PIC）、群體雜合度（Heterozygosity，He）和有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）；采用Mega5.2分析軟件構建其系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA瓊脂糖檢測結果

將提取的部分基因組DNA采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰（圖1），說明提取的 DNA在濃度、純度和質(zhì)量上均較好。

圖1 藏羊基因組DNA部分瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Part Agarose Gel Electrophoresis results of Tibetan sheep genomic DNA

2.2 PCR擴增產(chǎn)物非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

PCR產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用快速銀染法顯色。圖2、圖3分別為微衛(wèi)星座位CMC133和AE129擴增產(chǎn)物的部分電泳圖譜，顯示CMC133和AE129微衛(wèi)星座位在不同個體擴增產(chǎn)物的電泳結果。由圖2、圖3可知，同一微衛(wèi)星座位對不同個體擴增產(chǎn)物不同，說明存在多態(tài)性。

圖2 策勒黑羊在微衛(wèi)星位點CMC133的部分擴增結果Fig.2 A portion of PCR results of CMC133 in Cele sheep

圖3 多浪羊在微衛(wèi)星位點AE129的部分擴增結果Fig.3 A portion of PCR results of AE129 in Duolang sheep

2.3 等位基因變異分析

通過對6個綿羊群體263只個體8個微衛(wèi)星座位的PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，共發(fā)現(xiàn)130個等位基因。各微衛(wèi)星座位等位基因的分布（表3）顯示，在座位OarFCB304上發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)較多，為20個，在座位MCM133上發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)較少，為10個。等位基因的變異范圍為2-38 bp，以座位OarFCB304上的變異范圍最大。

表3 不同微衛(wèi)星座位的等位基因Tab.3 Alleles of different microsatellite loci

2.4 遺傳多樣性分析

表4顯示了6個綿羊品種中8個微衛(wèi)星座位的平均PIC、He以及Ne，其中藏羊在PIC與He中最高，分別為0.8715和0.8922，在巴音布魯克中最低分別為0.8350和0.8629；Ne在巴什拜羊群體中最高為9.8722，其次是藏羊群體為9.5361，最低的是巴音布魯克群體為7.6882。由表4可見，6個綿羊品種中藏羊和巴什拜羊的遺傳多樣性較豐富，巴音布魯克羊遺傳多樣性相對較低。

表4 6個綿羊群體中8個微衛(wèi)星座位的PIC、He和NeTab.4 PIC，He，Ne of 8 microsatalfite locus in 6 sheep groups

2.5 遺傳距離及進化樹的構建

由圖4可知，策勒黑羊與巴什拜羊聚為一類，巴音布魯克羊與藏羊先聚為一類，然后與阿勒泰羊聚在一起。由表5可知，藏羊和策勒黑遺傳距離最遠為0.79，巴什拜羊與多浪遺傳距離最近為0.26。

圖4 6個綿羊群體NJ方法聚類Fig.4 The dendrogram of Neighbor-joining(NJ)method in 6 sheep groups

表5 6個綿羊群體間的遺傳距離Tab.5 Genetic distances between breeds of six sheep

3 討論

（1）本試驗所選的綿羊8個微衛(wèi)星座位，分別位于8條不同的染色體上，可最大限度地提供遺傳信息。8個微衛(wèi)星座位共檢測到130個等位基因，平均等位基因大小為16.25 bp，其中最高的Ne是OarFCB304，為 20個，而 OarFCB48、BMS1004和SRCRSP9最低，為16個。因為一般選擇Ne在5-19個為宜，這是因為Ne太少，不能提供足夠的信息量，所以本研究選取8個微衛(wèi)星位點。

（2）PIC能夠反映微衛(wèi)星片段多態(tài)性。Botstein等[14]]最早提出采用PIC衡量基因變異程度：當PIC＞0.5時，該位點為高度多態(tài)位點；0.25＜PIC＜0.5時為中度多態(tài)性位點；PIC＜0.25時為低度多態(tài)位點。在檢測的8個微衛(wèi)星座位中，巴音布魯克的PIC最低，為0.8356。5個群體的PIC均大于0.5，表明這些群體均呈高度多態(tài)，適宜用于綿羊品種間遺傳多樣性分析，同時也表明本研究群體提供的遺傳信息較高，具有較大的利用潛力。8個微衛(wèi)星座位使6個品種綿羊之間存在差異，如巴什拜羊的多態(tài)信息含量0.8664，而策勒黑羊為0.8618，這種差異可能是綿羊品種在長期的自然和人工選擇過程造成的。

（3）He反映各群體在多個位點上的遺傳變異，被認為是度量群體遺傳變異的1個最適參數(shù)就相同的分子標記而言，He的高低反映了群體的遺傳一致性程度。He越低，表明該群體的遺傳一致性越高，而群體的遺傳變異越少，群體遺傳多樣性越低[15]，反之，則多樣性越高。本實驗用8個微衛(wèi)星標記對6個肉用綿羊品種進行了遺傳多樣性分析，得出6個綿羊品種He 0.8629-0.8922，高于賈斌等[16]在新疆8個綿羊品種遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關系的微衛(wèi)星分析研究結果（He為0.5306-0.6224），也高于湯存?zhèn)17]在新疆13個綿羊品種遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析研究結果（其He 0.6754-0.7530），這說明其原因一方面與選擇的微衛(wèi)星位點有關，另一方面說明所選的6個綿羊品種具有豐富的遺傳變異。

（4）群體聚類分析能直觀反映親緣的遠近，策勒黑羊與巴什拜羊聚為一類，這與閏景娟等[19]研究結果一致。本研究結果將巴音布魯克羊與藏羊先聚為一類，然后與阿勒泰羊聚在一起，這與楊燕等[11]的研究結果一致。而新疆當?shù)厝嗣駥⒍嗬搜虬旬數(shù)氐耐练N羊，在本品種選育基礎上，從塔什庫爾干引入的半粗毛羊，經(jīng)過長期繁育而成。符合地理分布。

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