宋歡，王貝貝，趙寧，王海霞，孫艷梅，王俊剛，申紅

（石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體防御外界病原體侵襲時產(chǎn)生的由基因編碼、核糖體合成的一類小分子活性多肽，是生物體內先天性防御系統(tǒng)的重要組成成分，具有非特異性的抗細菌、真菌、病毒等作用，且不破壞機體正常細胞的小分子多肽[1]。目前，已從細菌、昆蟲、植物和脊椎動物，包括人類中分離獲得抗菌肽，其中昆蟲是地球上種類最多、數(shù)量最大的生物類群，其防御系統(tǒng)獨特，當其受到某些物理刺激或微生物感染后，會引起免疫反應，產(chǎn)生一系列抗菌物質。蝗蟲屬于昆蟲，在我國分布較廣泛。新疆石河子位于蒙新區(qū)的西部，是亞洲飛蝗(Locusta migratoria L.）的聚集地[2]。亞洲飛蝗屬直翅目蝗科，群居性昆蟲，存在獨特的免疫機制，但有關亞洲飛蝗幼蟲抗菌肽的抑菌活性以及特性方面的研究報道較少。

因此，本研究以亞洲飛蝗幼蟲為材料，在前期研究細菌誘導蠅蛆24 h產(chǎn)生的抗菌肽濃度較高和強抑菌活性的基礎上，對其誘導24 h產(chǎn)生的抗菌肽進行提取，并對其部分理化特性進行研究，旨在為其作為新型抗生素替代物提供新的思路和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試蟲

亞洲飛蝗由石河子大學農(nóng)學院昆蟲實驗室提供。

1.1.2 菌種

大腸桿菌、葡萄球菌由石河子大學動物科技學院傳染病實驗室提供。

1.1.3 試劑和藥品

甲醛、冰乙酸、氨水、2‰巰基乙醇、35μg/mL苯甲基磺酰氟、無水乙醇、85%磷酸、考馬斯亮藍G-250、標準蛋白質溶液 (用結晶牛血清白蛋白與純化水配制而成，濃度為100μg/mL)、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉、鹽酸溶液等均為分析純級。

1.2 方法

1.2.1 亞洲飛蝗抗菌肽誘導

挑選體重相近的亞洲飛蝗幼蟲100只，隨機分成4組：大腸桿菌誘導組、葡萄球菌誘導組、大腸桿菌和葡萄球菌混合菌誘導組(采用濃度為1×108CFU/mL菌液2μL分別從亞洲飛蝗腹部注射)和對照組（未處理)。將以上試驗組處理的亞洲飛蝗幼蟲置于溫度為25-32℃，相對濕度為65%-70%的條件下正常飼喂，于飼喂24 h后挑取活的蟲體，以備測定。

1.2.2 亞洲飛蝗抗菌肽提取

參考朱小奇等[3]的方法，采用乙酸銨緩沖液浸提方法選取不同細菌誘導的亞洲飛蝗幼蟲，用蒸餾水反復沖洗，并用75%乙醇消毒，吸干蟲體表面液體，稱量后置于研缽中，按重量/體積比為 1∶3加入提取液 (0.05 mol/L、pH=5的乙酸銨緩沖液，35 μg/mL的苯甲基磺酰氟（PMSF），2‰巰基乙醇)，充分研磨，勻漿液于4℃，12000 r/min離心30 min取上清液，重復3次，合并上清液，放至100℃的恒溫水浴箱中水浴5 min，然后以4800 r/min在4℃離心30 min，去除變性蛋白，用滅菌注射器抽取不含油層的上清液，裝于小試管中標記后放于-20℃冰箱中冷凍備用。

1.2.3 亞洲飛蝗抗菌肽提取液濃度測定

考馬斯亮藍法(Bradford法)測定亞洲飛蝗抗菌肽粗提取液的濃度。用分光光度計測定標準蛋白（結晶牛血清白蛋白）OD595值，以標準蛋白濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值OD595為縱坐標，繪制標準曲線（圖1），測定各試驗組抗菌肽粗提液OD595值，結合標準曲線求得亞洲飛蝗抗菌肽粗提液濃度。

圖1 標準蛋白曲線Fig.1 Standard protein cure

1.2.4 亞洲飛蝗抗菌肽提取液部分理化特性的測定

1.2.4.1 熱穩(wěn)定性

將葡萄球菌誘導24 h的亞洲飛蝗抗菌肽提取液分別于 50、60、70、80、90和 100 ℃水浴中加熱10 min，12000 r/min（4℃）離心 15 min，對每個溫度組分別收集上清液，使用游標卡尺測定對葡萄球菌的抑菌直徑，每個處理設3次重復，未經(jīng)熱處理的樣品為對照組，將對照組的抑菌率設定為l00%。

1.2.4.2 反復凍融的穩(wěn)定性

將葡萄球菌誘導24 h的亞洲飛蝗抗菌肽提取液置于 -20℃冰箱分別反復凍融 l、2、4、6、8和 10次，凍融后的提取液于12000 r/min、4℃離心15 min，分別收集上清液，用游標卡尺法測定其對葡萄球菌的抑菌活性，每個處理設3次重復，以不凍融的樣品作為對照組，將對照組的抑菌率定為l00%。

1.2.4.3 不同pH處理對抗菌肽提取液活性的影響

用鹽酸和氨水配置 pH分別為 1、3、5、7、9的溶液，將這些溶液分別與經(jīng)葡萄球菌誘導的亞洲飛蝗的抗菌肽提取液等體積混合，室溫放置l h后檢測其對葡萄球菌的抑菌活性，以加等量生理鹽水的抗菌肽粗提液作對照，每個處理設3次重復。未經(jīng)pH溶液處理的樣品為對照組，將對照組的抑菌率設定為l00%。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 17.0的One Way ANOVA程序進行數(shù)據(jù)的差異性檢驗。蟲，測定其抗菌肽粗提液濃度，結果顯示用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及其混合菌誘導亞洲飛蝗24 h的抗菌肽粗提液濃度間差異不顯著，但均高于未經(jīng)誘導的亞洲飛蝗組的濃度，與洛雪等[6]研究“用針刺蘸大腸桿菌可以誘導亞洲飛蝗抗菌物質的表達，并在誘導24 h時產(chǎn)生的抗菌肽濃度最高”的結果一致。這提示用不同的細菌誘導刺激亞洲飛蝗幼蟲均可以使其產(chǎn)生高表達量的抗菌肽，可能是細菌引起亞洲飛蝗幼蟲的誘導型表達屬于適應性免疫。

（2）隨著抗菌肽一系列功能活性的不斷發(fā)現(xiàn)，一些直接影響抗菌肽功能活性的理化性質也開始受到關注。Garcia-Olmedo等[7]研究表明，抗菌肽的疏水性增加時，其抗菌活性也逐漸升高；但當疏水性達到一定程度時，該肽段將喪失對真核細胞與原核細胞之間的選擇性，繼而對真核生物也產(chǎn)生毒性。據(jù)此，本實驗對亞洲飛蝗幼蟲抗菌肽粗提液的部分理化特性進行了研究，用不同溫度處理葡萄球菌誘導亞洲飛蝗幼蟲的抗菌肽提取液對葡萄球菌抑菌活性的測定結果表明，50-70℃處理的亞洲飛蝗抗菌肽的抑菌活性與未經(jīng)熱處理的對照組間差異不顯著（P＞0.05），而經(jīng)80-100℃處理的抗菌肽提取液顯著低于對照組（P＜0.05），溫度為100℃時的抑菌率仍然為82.65%，這提示亞洲飛蝗抗菌肽可以耐受高溫且具有較好的熱穩(wěn)定性。這可能是因為抗菌肽在水溶性環(huán)境中無穩(wěn)定構象，只有在結合上或接近細胞膜時才形成其發(fā)揮功能的高級結構[3]。

（3）亞洲飛蝗抗菌肽粗提液反復凍融的試驗結果顯示，凍融6次以內的抗菌肽與對照組 (未經(jīng)凍融)差異不顯著（P＞0.05），凍融8-10次的抗菌肽抑菌活性低于對照組（P＜0.05），這提示隨著凍融次數(shù)的增多，亞洲飛蝗抗菌肽粗提液的抑菌活性逐漸減小，但其凍融10次抑菌率仍在77%以上。由此可見，少次數(shù)的反復凍融不會對亞洲飛蝗抗菌肽的活性產(chǎn)生顯著影響。這提示亞洲飛蝗抗菌肽可能有耐受低溫和反復凍融特性。

（4）據(jù)報道大多數(shù)昆蟲抗菌肽顯堿性，其等電點大于7[8-9]。本試驗對亞洲飛蝗抗菌肽粗提液經(jīng)不同pH溶液處理，結果顯示經(jīng)pH酸性溶液處理時，亞洲飛蝗抗菌肽對葡萄球菌抑菌活性較好，pH為7時的抑菌率達到了92.97%，但隨著pH值的增加，溶液過堿會影響抗菌肽的活性（P＜0.05）。這提示亞洲飛蝗抗菌肽具有一定的抗酸堿性能。

對亞洲飛蝗抗菌物質誘導表達及其部分理化特性的研究結果表明，亞洲飛蝗抗菌肽具有耐高溫和耐酸堿等較穩(wěn)定的生物學特性，抑菌效果好。本研究可為其今后在畜牧生產(chǎn)上的應用提供參考，而對于其結構、功能和抗菌機理還需要更深入的研究。

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