李 欣

(成都大學體育學院，四川 成都610600)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可以感受細胞所處環(huán)境的營養(yǎng)狀態(tài)和能量狀態(tài)，是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞營養(yǎng)狀態(tài)、能量狀態(tài)的傳感器，它處于PI3K/Akt信號通路的下游，能感受并整合經(jīng)PI3K信號通路傳遞的生長因子信號，在調節(jié)細胞生長和細胞周期中起非常關鍵的作用［1］．目前的研究表明，其調節(jié)作用主要集中在以下幾個方面:(1)通過影響p70S6K的活性而調控核糖體的生成;(2)通過改變4E-BP1的磷酸化狀態(tài)而調控翻譯起始復合物的功能;(3)通過影響真核延伸因子-2激酶，而調控多肽鏈的延伸［2］．

1 結構

在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)兩種可被雷帕霉素抑制的基因:TOR1和TOR2，其編碼的雷帕霉素靶蛋白是一種高度保守的大分子蛋白，可以抵抗免疫親和蛋白-免疫抑制劑復合物(FKBP-雷帕霉素)的生長抑制效應．TOR1和TOR2基因編碼兩種分子量為280道爾頓，相似度70%的TOR1和TOR2蛋白，其哺乳動物直向同源物為mTOR，mTOR蛋白與酵母TOR相比，其氨基酸序列有42%的相似，蛋白包括2 549個氨基酸和幾個保守的結構功能域．N端包括20個連續(xù)的由37-47個氨基酸殘基組成的HEAT重復序列，分為兩簇，構成一對反向平行α-螺旋結構，調節(jié)復合蛋白質中蛋白與蛋白間的親和力［3］．

TOR蛋白在C端有一個與PI3K和肌醇磷脂4位激酶高度同源的催化功能域，其相關蛋白家族成員包括:MEC1、TEL1、RAD3、MEI-41、DNA-PK、ATM、ATR和TRRAP．．這些蛋白的C端都有一個同源的磷脂酰肌醇激酶功能域，因此被稱為PI3K-相關激酶蛋白家族．但mTOR從功能上看是還是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它還包括一個FKBP-雷帕霉素結合功能域(FRB)，該功能域可以出現(xiàn)氨基酸替換，阻止FKBP-雷帕霉素復合物與mTOR的結合，在FRB和催化功能域間存在一個約為500氨基酸序列的FAT功能域，起到支架或蛋白-蛋白作用功能域的作用．在C端還含有一個大約35個氨基酸的延伸序列:FATC功能域，該功能域為mTOR活性所必需，去除任意一個該功能域的氨基酸都會使mTOR活性喪失［4］，F(xiàn)ATC和FAT相互作用可產(chǎn)生催化功能，在兩個功能域間，可能還存在一個陰性調節(jié)功能域NRD．其具體結構見圖1［3］．

在哺乳動物體內(nèi)，mTOR一般以兩個功能不同的復合物形式存在:mTORC1和mTORC2［5］．mTORC1時，mTOR與兩個高度保守的蛋白質Raptor和G蛋白β亞基樣蛋白結合，Raptor是種進化保守的分子量為150道爾頓，其與mTOR的HEAT功能域，以及p70S6K和4E-BP1上的TOR信號模序結合．Raptor可通過穩(wěn)定mTOR的正確折疊，或作為支架蛋白將底物募集到激酶功能域附近，或通過調節(jié)mTOR的細胞內(nèi)定位來介導mTOR對營養(yǎng)物質的感受［6］．Raptor和mTOR之間的相互作用需要G蛋白β亞基樣蛋白(G protein β-subunit-like protein，GβL)，其是另一種mTOR的結合蛋白，分子量為36道爾頓，含有7個WD-40重復序列，可直接結合到mTOR的催化功能域，參與mTOR對氨基酸水平的感受．mTORC2時，mTOR與Rictor、mSIN1和GβL形成復合物．mTORC2最有特性的功能是可以磷酸化Akt的絲氨酸殘基473，而該殘基正是Akt磷酸化mTORC1的位點，且Akt的轉角基序蘇氨酸殘基450也需要mTORC2的磷酸化，因此，在Akt信號通路中，mTORC2位于Akt的上游，而mTORC1則位于Akt的下游［7］．

圖1 mTOR結構示意圖

2 mTOR的上游調節(jié)因子

2．1 營養(yǎng)物質對mTOR的調節(jié)

當TOR1和TOR2蛋白從出芽酵母中提取出來時，也發(fā)現(xiàn)了與它們結合的蛋白質:AVO1、AVO2、AVO3、LST8和KOG1．AVO1、AVO2、AVO3只和TOR2結合，而LST8和KOG1則可與TOR1或TOR2任意單獨的結合．其結合不受雷帕霉素或營養(yǎng)剝奪的影響．但當mTOR-Raptor結合后，營養(yǎng)環(huán)境對mTOR與底物結合并磷酸化的能力有顯著影響，在存在雷帕霉素或營養(yǎng)剝奪時，mTOR基因的細胞周期停留在G0期，mTOR-GβL-Raptor與底物的結合能力喪失;而當營養(yǎng)充裕時，Raptor與mTOR的底物間的親和力增加．值得注意的是，雷帕霉素可以導致Raptor與mTOR間的解離，而營養(yǎng)剝奪則不會．

細胞內(nèi)的氨基酸水平也可以調節(jié)mTOR的活性，其中亮氨酸的作用最為顯著［8］．亮氨酸濃度的增高可以通過Rheb和AMKP，而不是生長因子信號通路來增加mTOR的活性，但其控制mTOR活性的具體機制尚不明了，現(xiàn)有證明表明這可能與線粒體代謝變化相關［9］．mTOR也可通過調節(jié)氨基酸透酶的活性來調節(jié)細胞內(nèi)的氨基酸濃度．ATP濃度下降或線粒體功能失調會激活AMKP，從而抑制mTOR表達［10］．在缺氧或低血糖時，細胞內(nèi)升高的腺苷單磷酸活化蛋白通過變構作用激活AMKP，磷酸化其下游靶因子，抑制mTOR，降低ATP的消耗．AMPK也可磷酸化mTOR的負調控因子TSC2，而減弱mTOR表達．

2．2 PI3K

mTOR的活性可被生長因子調節(jié)，胰島素和其他生長因子可顯著增加mTOR敏感型的S6K和4EBP1的磷酸化程度．PI3K的激活可以使4E-BP1因胰島素引起的磷酸化程度達到最大，當使用PI3K抑制劑渥曼青霉素和LY294002時，S6K和4EBP1的磷酸化程度降低，這些證據(jù)表明生長因子引起的mTOR的激活須經(jīng)PI3K介導，即PI3K是mTOR上游的正性調節(jié)因子［11］．在HEK-293細胞株中，過表達的PI3K催化亞基-p110可以在缺乏生長因子或胰島素時，導致4EBP1的磷酸化，負性調節(jié)亞基P85的過表達能抑制胰島素誘導的S6K的磷酸化．這些結果與PTEN缺乏后細胞中4E-BP1和p70S6K高水平磷酸化的變化是一致的．

2．3 Akt

絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶Akt是PI3K的下游效應物，在調節(jié)mTOR活性中具有重要作用．哺乳動物細胞表達三種由不同基因編碼的Akt蛋白．Akt激活的限速步驟包括PH功能域與PI3K結合-異位至細胞膜-被PDK1磷酸化．HEK-293細胞株中過表達的完全激活形式的Akt可以在缺乏生長因子和存在渥曼青霉素時，提高4E-BP1的磷酸化程度．而具有顯性負效應的Akt可以損壞胰島素誘導的4E-BP1的磷酸化．這些表明Akt是mTOR的上游調控因子［12］．當缺乏Akt1和Akt2時，p70S6K的磷酸化下降程度少于4E-BP1，提示p70S6K的磷酸化主要依賴于Akt3，而4E-BP1的磷酸化更依賴于Akt3．但一些實驗對Akt作為mTOR上游正性調節(jié)因子的地位表示了懷疑:在哺乳動物細胞中p70S6K的磷酸化與Akt的活性并不總是保持一致;Akt作用于mTOR的機制仍不明了，mTOR擁有兩個臨近的磷酸化位點，蘇氨酸殘基2446和絲氨酸殘基2448，Akt可磷酸化絲氨酸殘基2448，而這兩個殘基均位于mTOR的負性調節(jié)功能域中，且這兩個氨基酸被丙氨酸替換后對mTOR的活性沒有影響．

2．4 TSC1/TSC2

結節(jié)性硬化癥的的錯構瘤蛋白和結節(jié)蛋白是由結節(jié)性硬化癥中腫瘤抑制突變基因TSC1和TSC2編碼的，這兩種蛋白質通過N端連接，組成一個異二聚體復合物，形成一個抑制mTORC1活性的功能單位，是mTOR的上游負調控因子．該二聚體缺乏時，p70S6K和4E-BP1的磷酸化程度均增高，可產(chǎn)生與PTEN突變相似的細胞和器官體積增大的效果，而該二聚體過表達時，p70S6K和4E-BP1的磷酸化程度均降低．TSC2含有一個GTP酶激活蛋白(GAP)的功能域域，刺激小G蛋白Rheb內(nèi)在的GTP酶活性，從而使Rheb轉化為GDP結合的滅活狀態(tài)．而當Rheb是GTP結合狀態(tài)時，它可激活mTORC1．在受到生長因子作用時，活化的Akt可以直接磷酸化TSC2的氨基酸殘基，而使其失去抑制Rheb作用的活性來激活mTOR．但過表達的TSC2發(fā)生α替代變異時，可阻斷Akt介導的mTORC1的激活．這些表明Akt介導的TSC2的磷酸化對調節(jié)mTORC1活性十分重要［13］．Rheb是TSC2GTP酶的一個直接底物．營養(yǎng)豐富時，Rheb處于活化狀態(tài)，與GTP結合，并與包括mTOR在內(nèi)的多種蛋白發(fā)生作用．而營養(yǎng)缺乏時，TSC2的GTP酶激活蛋白域誘導Rheb水解失活形成Rheb-GDP，從而抑制mTOR活性．總之，Rheb是位于TSC1/TSC2復合物下游，mTOR的正調控因子．同時，TSC2是細胞內(nèi)AMP/ATP比例感受器AMPK的直接底物，ATP水平下降時，磷酸化狀態(tài)的AMPK能磷酸化并激活TSC2，從而通過Rheb抑制mTOR信號［14］．

3 mTOR的下游效應物

mTOR受氨基酸或生長因子刺激時，可以經(jīng)激活p70S6K和抑制4EBP-1來控制翻譯起始，p70S6K的激活可以導致核糖體蛋白S6的磷酸化，從而使5'TOP mRNAs翻譯，這種mRNA含有大量的轉錄產(chǎn)物，可以編碼大部分的核糖體蛋白和翻譯元件．因此，通過控制5'TOP mRNAs翻譯，mTOR上調了翻譯效率．4EBP-1是翻譯抑制物，可被mTOR磷酸化滅活，從而與eIF4E脫離，eIF4E可與帽結構結合，開始帽依賴性翻譯．

3．1 4E-BPs

eF4E和eIF4G的相互作用受4E-BPs調控，哺乳動物的4E-BPs是由3種不同的基因編碼而成的低分子量蛋白:4E-BP1、4EB-P2和4E-BP3．低磷酸化的4E-BPs與eIF4E有著高度的親和力，而高磷酸化的4E-BPs則不與eIF4E作用［15］．4E-BPs的磷酸化位點包括:蘇氨酸殘基37、蘇氨酸殘基46、絲氨酸殘基65、蘇氨酸殘基70、蘇氨酸殘基83、絲氨酸殘基101和絲氨酸殘基112．4E-BPs從eIF4E上脫落時，其殘基磷酸化按蘇氨酸殘基37、蘇氨酸殘基46、絲氨酸殘基65、蘇氨酸殘基70的順序進行．mTOR只磷酸化絲氨酸殘基65時，4E-BP1無法與eIF4E分離，但當用一個氨基酸去替代絲氨酸殘基65時，會大大減弱4E-BP1與eIF4E的結合，因此其余殘基的磷酸化協(xié)同會加快4E-BP1與eIF4E的解離．

3．2 p70S6K

哺乳動物細胞含有兩種由不同基因編碼的S6激酶，S6激酶調節(jié)細胞生長，是TOR蛋白的直接靶物質，S6激酶通過作用于其直接下游效應因子S6蛋白，增加mRNA的翻譯效率來控制細胞生長．S6蛋白的磷酸化與5‘TOP mRNA的翻譯效率相關，但目前的研究表明S6蛋白并不是調節(jié)5‘TOP mRNA翻譯的唯一因子．eIF4B也是S6K的靶物質，eIF4B對RNA解旋酶eIF4A具有調節(jié)作用，其絲氨酸殘基422是S6K的特異性磷酸化位點，因此eIF4B可能是S6K在翻譯和細胞生長中的重要調節(jié)因子，由于eIF4B能幫助eIF4A打開RNA的二級結構，所以eIF4B的磷酸化程度增強能提高具有二級結構的mRNA的翻譯效率．

3．3 eIF4G

eIF4G是一個支架蛋白，在組裝核糖體起始復合物中起著關鍵作用．eIF4G包括eIF4G1和eIF4G2，均包括三個通過鉸鏈區(qū)連接的功能和結構域．兩者都是磷蛋白，但他們的磷酸化調節(jié)方式不同，當受到血清、胰島素和生長因子的刺激時，eIF4G1的磷酸化程度高于eIF4G2，eIF4G1包括兩簇磷酸化位點，一個位于N端的絲氨酸殘基314，另一個在蛋白中間的鉸鏈區(qū)，包括絲氨酸殘基1148、1188和1232，對PI3K和mTOR抑制劑敏感．當eIF4G被mTOR磷酸化時，發(fā)生構象改變，活性增加［16］．

3．4 真核延伸因子-2激酶

mTOR對翻譯的調節(jié)中還存在其它靶蛋白:真核生物延伸因子-2激酶．真核延伸因子-2蘇氨酸殘基56的磷酸化可導致失活，雷帕霉素能通過對真核延伸因子-2激酶的影響來抑制真核延伸因子-2的去磷酸化．雷帕霉素磷酸化真核延伸因子-2激酶的位點為絲氨酸殘基78位，359和366［17］．

4 研究展望

mTOR不僅在細胞生長中控制mRNA翻譯，調控蛋白質合成，而且還參與刺激基因的轉錄過程．營養(yǎng)物質充足時，mTOR能通過將一些受營養(yǎng)調控的轉錄因子滯留在細胞質中，從而抑制這些饑餓特異性基因的轉錄．通過對轉錄因子STAT3一級結構的研究發(fā)現(xiàn)，其存在TOR識別基序(TOR signaling)，提示其可能被Raptor募集，而后被mTOR磷酸化．目前的研究已證實聚合酶I特異性轉錄因子上游結合因子UBF和轉錄起始因子1A也是受mTOR調節(jié)的靶物質．mTOR可以通過UBF來刺激rRNA的轉錄．

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