miR-18a在老年胃癌患者血清中的表達(dá)及意義

湯光華張英志

(嘉興市第一醫(yī)院消化科，浙江嘉興314000)

摘要〔〕目的探討胃癌患者血清microRNA-18a表達(dá)變化及其臨床診斷意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測52例老年胃癌患者和33例健康體檢者血清miR-18a表達(dá)水平。通過分析受試者工作特征曲線(ROC)判斷miR-18a表達(dá)水平在胃癌診斷中的靈敏度和特異度。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測患者血清腫瘤標(biāo)記物水平。結(jié)果胃癌患者血清miR-18a較健康對(duì)照組高(P<0.05)。血清miR-18a水平與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，與分化程度、臨床分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。ROC分析結(jié)果顯示最佳的miR-18a相對(duì)表達(dá)量的臨界值為2.77，診斷靈敏度77.2%，特異度82.8%，ROC曲線下面積為0.791。血清miR-18a 水平與胃癌相關(guān)抗原MG7-Ag明顯正相關(guān)，與糖抗原(CA)-72-4、CA-50和甲胎蛋白(AFP)正相關(guān)，與癌胚抗原(CEA)無明顯相關(guān)性。結(jié)論miR-18a在胃癌患者血清中水平升高，作為新的血清學(xué)指標(biāo)在胃癌篩查診斷中有重要參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞〔〕胃癌；miR-18a；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；診斷

中圖分類號(hào)〔〕R735〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：湯光華(1975-)，男，主治醫(yī)師，主要從事老年性疾病血清標(biāo)志物檢測及輔助診斷研究。

微小RNA(miRNA)參與了人類基因組中約1/3基因的表達(dá)調(diào)控，廣泛參與細(xì)胞的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長、分化、凋亡甚至腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程，特異性的miRNA發(fā)揮著重要的作用〔1〕。在血液中檢出腫瘤特異性miRNA并將其作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)志對(duì)于腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷具有重要意義〔2〕。在胃癌(GC)組織中具有特異性的miRNA表達(dá)譜〔3〕，其中miR-18a特異性高表達(dá)〔4〕。本研究通過檢測GC患者血清miR-18a水平變化，探討其臨床診斷意義。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2010年1月至2013年12月本院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的老年GC患者52例，收集患者確診時(shí)采集的血清樣本，其中男33例，女19例，年齡62～79〔平均(68±8.2)〕歲。采用2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(UICC/AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期26例，Ⅲ期8例，Ⅳ期6例。所有患者排除其他腫瘤或病毒感染疾病，入組患者在采集血液標(biāo)本前均未經(jīng)手術(shù)、放療以及化療。同期33例健康體檢者作為正常對(duì)照組。兩組年齡、性別比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性(P>0.05)。在采集樣本前均獲得患者或家屬的知情同意。

1.2主要試劑和儀器RNA提取試劑盒TRIZOL Reagent，美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒iScriptcDNA synthesis kit以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒iQTMSYBR?Green Supermix，美國Bio-Rad公司；運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)miRNA-18a和U6的特異性引物，miRNA-18a正義引物：5′TGTCGGGTAGCTTATCAGAC3′，反義引物：5′TTCAGACAGCCCATCGACTG3′;U6正義引物：5′CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 3′，反義引物：5′ ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC 3′，均由上海生工生物工程有限公司合成。在Bio-Rad iQ5定量PCR儀器上進(jìn)行反應(yīng)。紫外分光光度計(jì)NanoDrop ND-1000(NanoDrop，Wilmington，美國)。

1.3方法

1.3.1血清標(biāo)本采集及總RNA提取收集清晨空腹外周血5 ml，室溫靜置30 min后取1.0 ml上清液，4℃、820 r/min離心10 min；取上層血清至新的離心管中，4℃、16 000 r/min離心10 min，取上清液到新的離心管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣本血清總RNA提取方法完全按照RNA提取試劑盒TRIZOL Reagent的操作說明進(jìn)行?？俁NA濃度和純度利用紫外分光光度計(jì)NanoDrop ND-1000進(jìn)行測定?？俁NA提取的質(zhì)量利用1%變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。獲得的符合濃度和質(zhì)量要求的RNA溶液保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2miRNA逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測血清miR-18a表達(dá)量按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，主要反應(yīng)條件：25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。以合成的cDNA為模板，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。第1步，95℃預(yù)熱3 min；第2步，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析0.5℃/0.5 min：55℃～95℃。同時(shí)以U6小核RNA(snRNA)管家基因作為內(nèi)參照。結(jié)果在Bio-Rad熒光定量PCR-iQ5軟件進(jìn)行分析。每個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct表示，ΔΔCt=(CtHCC-miR18a-CtHCC-U6)-(CtNC-miR18a-CtNC-U6)。每個(gè)樣本重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.3.3腫瘤標(biāo)記物的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測患者血清GC抗原(MG7-Ag)，糖抗原(CA)-72-4、CA-50、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)的水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。通過受試者工作特征曲線(ROC)判斷miRNA-18a表達(dá)水平在GC診斷中的靈敏度和特異度。

2結(jié)果

2.1血清miR-18a在GC患者及正常組織中的表達(dá)miR-18a在GC患者血清內(nèi)的相對(duì)水平是健康對(duì)照組的(2.57±0.46)倍(P<0.05)。

2.2血清miR-18a水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系血清miR-18a水平與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，與分化程度、臨床分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.3血清miR-18a 水平對(duì)GC的診斷價(jià)值ROC曲線下面積(AUC)為0.791(95%CI0.715～0.901)。見圖1。根據(jù)ROC分析，最佳的miR-18a相對(duì)表達(dá)量的臨界值為2.77，診斷靈敏度76.9%，特異度82.6%。

表1　血清miR-18a水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1　血清miR-18a診斷胃癌的ROC

2.4血清miR-18a 水平與腫瘤標(biāo)記物在GC中相關(guān)性分析血清miR-18a 水平與GC相關(guān)抗原MG7-Ag明顯正相關(guān)(r=0.787,P=0.008)，與CA-72-4、CA-50和AFP正相關(guān)(分別r為0.335、0.216、0.431，均P<0.05)，與CEA無明顯相關(guān)性(r=0.052，P=0.134)。

3討論

miRNA通過與mRNA 3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA斷裂，抑制翻譯過程，或者通過miRNA脫腺苷作用介導(dǎo)mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔5〕。由于miRNA序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達(dá)方式的多樣性，決定了其在人類腫瘤信號(hào)通路中所起到的重要作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后〔6〕。

目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤組織中有其特異性的miRNA表達(dá)譜〔7～9〕；但組織中miRNA檢測的取材需要經(jīng)過手術(shù)或者穿刺，對(duì)篩查、監(jiān)測和診斷有一定的不便之處，對(duì)老年患者尤其不便。目前有研究表明〔2〕，miRNA在血清和血漿中也可能有穩(wěn)定的表達(dá)，血清或血漿放置在常溫或在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中以及反復(fù)冰凍及融解樣本不影響miRNA的穩(wěn)定性；血漿中miRNA耐核糖核酸酶，非常穩(wěn)定，并且血漿和血清中的樣本檢測有很好的相關(guān)性，都很適合作為血液基礎(chǔ)的標(biāo)記物。腫瘤患者某些外周血miRNA升高的原因可能是在腫瘤組織中超表達(dá)的miRNA以一定的方式釋放入外周血中，具有腫瘤特異性，有可能作為一種新型的特異性腫瘤標(biāo)志物〔10，11〕。

本研究結(jié)果提示血清miR-18a可能是GC的一個(gè)重要血清指標(biāo)，對(duì)早期無癥狀GC的診斷有一定指示作用。并且miR-18a可能在GC的進(jìn)展中起到重要作用，其水平變化可以作為腫瘤進(jìn)展的觀測指標(biāo)，對(duì)GC的篩查和早期診斷有一定的參考意義。通過分析ROC及血清miR-18a 水平與腫瘤標(biāo)記物在GC中的相關(guān)性進(jìn)一步證明，血清miR-18a可能是GC的一個(gè)重要血清指標(biāo)，對(duì)早期無癥狀GC的診斷有一定指示作用。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-05-16修回〕

(編輯袁左鳴)