miR-196a對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

蘇鵬飛李穎璐1段東奎

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院，河南南陽(yáng)473000)

摘要〔〕目的探討microRNA-196a(miR-196a)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)A549細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549與正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE中miR-196a的表達(dá)水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組、miR-196a抑制(轉(zhuǎn)染inhibitor)組和miR-196a過(guò)表達(dá)(轉(zhuǎn)染mimics)組。采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h各組的轉(zhuǎn)染效果，四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h的增殖能力，Western印跡法檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染48 h后的上皮表型標(biāo)志物〔角蛋白(CK)18和鈣黏蛋白(E-cadherin)〕和間充質(zhì)表型標(biāo)志物〔α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和纖連蛋白(FN)〕的蛋白水平，采用流式細(xì)胞儀和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)量各組轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h的A549細(xì)胞α-SMA陽(yáng)性率和細(xì)胞上清液中FN水平。結(jié)果A549細(xì)胞的miR-196a水平高于HBE細(xì)胞(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染miR-196a inhibitor或mimics可呈時(shí)間依賴的方式降低或升高A549細(xì)胞的miR-196a水平(P<0.05)；與對(duì)照組相比，miR-196a抑制組轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h的增殖率及α-SMA陽(yáng)性率和上清液FN水平均降低，轉(zhuǎn)染48 h的CK18和E-cadherin的蛋白水平升高，α-SMA和FN的蛋白水平降低；而miR-196a過(guò)表達(dá)組以上指標(biāo)的變化趨勢(shì)與miR-196a抑制組相反，與其余3組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論A549細(xì)胞中miR-196a呈高表達(dá)，抑制miR-196a表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖和EMT，而升高miR-196a表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖和EMT。

關(guān)鍵詞〔〕microRNA-196a；非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞增殖；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科二病區(qū)

第一作者：蘇鵬飛(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸外科研究。

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%以上，5年生存率僅約為11%〔1〕。研究〔2〕發(fā)現(xiàn)肺癌的發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化不僅受到遺傳因素影響，而且還受表觀遺傳學(xué)影響，其中小分子非編碼RNA中的miRNA發(fā)揮了重要作用。miRNA在生物體內(nèi)廣泛存在，可通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。新近研究發(fā)現(xiàn)microRNA-196a(miR-196a)在胃癌中發(fā)揮了癌基因的作用〔3〕。筆者推測(cè)miR-196a在肺癌中亦發(fā)揮重要作用，本研究在檢測(cè)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的基礎(chǔ)上，探討改變其水平對(duì)A549細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549及正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，LipofectamineTM 2000、TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miR-196a inhibitor、miR-196a mimics購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、FastStart DNA Master SYBR Green I購(gòu)自瑞士Roche公司，MTT、PVDF膜購(gòu)自美國(guó)sigma公司，角蛋白(CK)18、鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及纖連蛋白(FN)一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Sigaling Technology公司。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Prism 7000型定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，F(xiàn)ACScan流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó) Bio Rad公司，Elx800型自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) BioTek公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，置于37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3 d換液，待其達(dá)70%～80%融合度時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)參照說(shuō)明書進(jìn)行qPCR檢測(cè)A549細(xì)胞和HBE細(xì)胞中的miR-196a水平。由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成miR-196a及內(nèi)參U6的引物。miR-196a逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-CAGAAGGAATGATGCACAGCCAACAACA-3′；正義：5′-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3′,反義：5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′;U6逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反義:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′?？傓D(zhuǎn)錄體系為20 μl：RNA模板2.0 μl、上下游引物各0.8 μl、ROX Reference Dye(50×)0.5 μl、SYBR熒光染料試劑10.0 μl，ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用Ct值法(2-△△CT)法表示miR-196a的相對(duì)表達(dá)量。

1.4分組及轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組、空轉(zhuǎn)染組、miR-196a抑制組和miR-196a過(guò)表達(dá)組。對(duì)照組不作任何處理，而空轉(zhuǎn)染組、miR-196a抑制組和miR-196a過(guò)表達(dá)組按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染空載體、miR-196a inhibitor或miR-196a mimics。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h后采用qRT-PCR檢測(cè)各組的miR-196a水平來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果(方法同1.3)。

1.5四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT) 采用MTT法檢測(cè)改變miR-196a水平對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×105個(gè)接種于96孔板中，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后，加入5 μg/μl預(yù)先配好的MTT溶液20 μl，孵育4 h后加入DMSO(150 μl/孔)，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組的吸光值(A)。以對(duì)照組為參考，計(jì)算其余各組A值與對(duì)照組的比值以此計(jì)為增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western印跡收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，冰上充分裂解，高速離心后保留上清液，檢測(cè)其蛋白濃度。每孔取等量蛋白，與上樣緩沖液混勻后進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將目的蛋白半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入適量的CK18、E-cadherin、α-SMA及FN一抗(除CK18為1∶200外，其余為1∶100)，4℃孵育過(guò)夜，加入二抗(1∶5 000)，化學(xué)發(fā)光法來(lái)顯影后，采用Gel-Pro analyzer軟件分析各條帶的光密度，結(jié)果表示為各目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值。

1.7α-SMA陽(yáng)性率及上清液中FN水平檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，分別采用流式細(xì)胞術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)α-SMA陽(yáng)性率及FN水平，實(shí)驗(yàn)操作完全依據(jù)試劑盒說(shuō)明書完成。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用方差分析和Bonfferoni檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1肺癌細(xì)胞系中miR-196a表達(dá)水平A549細(xì)胞的miR-196a水平(15.39±2.74)高于HBE細(xì)胞(P<0.05)；miR-196a抑制組轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h的miR-196a水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，而miR-196a過(guò)表達(dá)組均高于其余3組(P<0.05)(P<0.05)；且空轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組miR-196a的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2miR-196a水平變化對(duì)A549細(xì)胞增殖率的影響與對(duì)照組相比，miR-196a抑制組轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h的增殖率均降低，且miR-196a過(guò)表達(dá)組均升高(P<0.05)；空轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組以上觀察點(diǎn)增殖率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較：2)P<0.05；與miR-196a抑制組比較：3)P<0.05；下圖、下表同 圖1　肺癌細(xì)胞系中miR-196a轉(zhuǎn)染情況

圖2　miR-196a水平變化對(duì)A549細(xì)胞增殖率的影響

2.3miR-196a水平變化對(duì)EMT標(biāo)志物蛋白水平的影響與對(duì)照組相比，miR-196a抑制組CK18和E-cadherin的蛋白水平升高，α-SMA和FN的蛋白水平降低，而miR-196a過(guò)表達(dá)組CK18和E-cadherin的蛋白水平降低，α-SMA和FN的蛋白水平升高(均P<0.05)；空轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組以上指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　miR-196a水平變化對(duì)EMT標(biāo)志物蛋白水平影響

2.4miR-196a水平變化對(duì)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞百分率的影響與對(duì)照組相比，miR-196a抑制組轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h的α-SMA陽(yáng)性率、FN水平均降低，而miR-196a過(guò)表達(dá)組均升高(P<0.05)；空轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組以上觀察點(diǎn)α-SMA陽(yáng)性率及FN水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2　miR-196a水平變化對(duì)α-SMA陽(yáng)性率及FN水平的影響

3討論

MicroRNA是一類單鏈非編碼小RNA分子，在進(jìn)化上較為保守，通過(guò)與靶基因mRNA特異性結(jié)合，繼而影響靶蛋白表達(dá)水平，發(fā)揮影響該蛋白參與信號(hào)通路的作用，故在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用〔4～6〕。由于癌組織和癌旁組織的miRNA譜存在差異，且某些miRNA表達(dá)在腫瘤中具有特異性，因此也被建議用于腫瘤的診斷、治療方案制訂及預(yù)后評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)miR-196a與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如尹凌帝等〔3〕發(fā)現(xiàn)miR-196a可通過(guò)HOXA5來(lái)調(diào)控胃癌細(xì)胞MGC-803的侵襲轉(zhuǎn)移。Huang等〔5〕發(fā)現(xiàn)miR-196a還可促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展，下調(diào)其水平可抑制腫瘤發(fā)展。以上提示miR-196a具有癌基因的作用，可作為癌癥治療的靶點(diǎn)。

本研究提示mir-196a在肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。通過(guò)qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染inhibitor可降低miR-196a水平，而轉(zhuǎn)染mimics可升高miR-196a水平，且轉(zhuǎn)染效果可持續(xù)至96 h，為研究其對(duì)肺癌細(xì)胞的影響提供了基礎(chǔ)。MTT檢測(cè)表明miR-196a可促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的增殖，具有一定的癌基因作用。EMT是癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟，作為生理病理現(xiàn)象，以上皮表型缺失及間質(zhì)表型的獲得為主要表現(xiàn)〔7〕。CK18和E-cadherin為經(jīng)典的上皮表型標(biāo)志物〔8～10〕，而α-SMA和FN為間質(zhì)表型標(biāo)志物〔11〕，因此其水平變化可用于評(píng)價(jià)EMT變化。本研究提示上調(diào)miR-196a表達(dá)可促進(jìn)EMT過(guò)程。而且miR-196a可促進(jìn)A549的EMT過(guò)程，但對(duì)于侵襲轉(zhuǎn)移的影響將是下步的研究重點(diǎn)。

綜上所述，A549細(xì)胞中miR-196a呈高表達(dá)，抑制miR-196a表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖和EMT，而升高miR-196a表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖和EMT。

4參考文獻(xiàn)

1Jemal A,Siegel R,Xu J,etal.Cancer statistics,2010〔J〕.CA Cancer J Clin,2010;60(5):277-300.

2Zheng T,Wang J,Chen X,etal.Role of microRNA in anticancer drug resistance 〔J〕.Int J Cancer,2010;126(1):2-10.

3尹凌帝,孫倩,林夢(mèng)潔,等.miR-196a調(diào)控HOXA5對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志,2014;19(3):193-8.

4Jin Z,Selaru FM,Cheng Y,etal.MicroRNA-192 and -215 are upregulated in human gastric cancer in vivo and suppress ALCAM expression in vitro 〔J〕.Oncogene,2011;30(13):1577-85.

5Huang F,Tang J,Zhuang X,etal.MiR-196a promotes pancreatic cancer progression by targeting nuclear factor kappa-B-inhibitor alpha 〔J〕.PLoS One,2014;9(2):e87897.

6胡欣春,魏益平,喻東亮,等.miR-21抑制物對(duì)A549細(xì)胞球增殖的影響及機(jī)制〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2014;34(9):2456-9.

7王海兵,張慧君,蘇晉梅,等.肺癌A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其對(duì)微小RNA表達(dá)的影響〔J〕.中華腫瘤雜志,2011;33(8):590-3.

8Shao R,Shi J,Liu H,etal.Epithelial-to-mesenchymal transition and estrogen receptor α mediated epithelialde differentiation mark the development of benign prostatic hyperplasia〔J〕.Prostate,2014;74(9):970-82.

9Wang YP,Yu GR,Lee MJ,etal.Lipocalin-2 negatively modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma through the epidermal growth factor(TGF-beta1)/Lcn2/Twist1 pathway 〔J〕.Hepatology,2013;58(4):1349-61.

10DI Fazio P,Montalbano R,Quint K,etal.The pandeacetylase inhibitor panobinostat modulates the expression of epithelial-mesenchymal transition markers in hepatocellular carcinoma models 〔J〕.Oncol Lett,2013;5(1):127-34.

〔2013-04-25修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)