蟲草多糖對(duì)哮喘模型大鼠血清白細(xì)胞介素-17和IgE水平動(dòng)態(tài)變化的影響

吳海弟劉禮榮陳永倖

(海南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南?？?70311)

摘要〔〕目的研究蟲草多糖對(duì)哮喘模型大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-17和IgE水平動(dòng)態(tài)變化的影響。方法選取SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為兩組，其中實(shí)驗(yàn)組60只，給予50 μg卵清蛋白(OVA)+150 μl氫氧化鋁干粉+50 μl生理鹽水腹腔注射，建立支氣管哮喘大鼠模型，正常對(duì)照組20只，予等量生理鹽水灌胃；造模成功過后，將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型組30只和蟲草組30只。蟲草組大鼠予150 mg/kg蟲草多糖每日一次灌胃，連續(xù)14 d；模型組大鼠給予等量的生理鹽水每日一次灌胃，連續(xù)14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)比實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠血清IL-17和IgE水平、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞比例、嗜酸性粒細(xì)胞比例及總細(xì)胞數(shù)。結(jié)果①實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清IL-17含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IL-17含量與模型組(13.01±1.65)比較明顯較低(P<0.05)；②實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IgE含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IgE含量與模型組比較明顯較低(P<0.05)。③實(shí)驗(yàn)組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯低于模型組(P<0.05)。④大鼠血清IL-17與IgE水平存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.963，P<0.01)。結(jié)論蟲草多糖能夠明顯降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，減輕炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕蟲草多糖；哮喘；白細(xì)胞介素-17；IgE

中圖分類號(hào)〔〕R562.2+5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：吳海弟(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

支氣管哮喘是由中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T嗜酸性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞參與而引起的一種氣道慢性炎癥性疾病〔1〕。本病臨床表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)而引起的氣喘、胸悶、咳嗽、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)低氧血癥，甚至危及生命〔2〕。中醫(yī)屬“哮病”的范疇。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，本病人們更加重視疾病防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取擴(kuò)張支氣管、激素類藥物抗炎等對(duì)癥療法〔3〕，但只能暫時(shí)控制病情發(fā)展，而且激素類藥物存在免疫力下降、體態(tài)改變、骨質(zhì)疏松等副作用，治療效果并不理想，亟需尋找治療哮喘的新思路。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘屬于變態(tài)反應(yīng)性疾病，發(fā)生過程中有大量的免疫細(xì)胞參與，與機(jī)體免疫功能的改變密切相關(guān)〔4〕，蟲草多糖能夠止咳、化痰、改善呼吸系統(tǒng)，能夠提高人體免疫力〔5〕，但關(guān)于其治療哮喘的實(shí)驗(yàn)研究較少，為了增強(qiáng)療效，緩解痛苦，改善哮喘患者預(yù)后。本文觀察蟲草多糖對(duì)急性哮喘模型大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-17和IgE水平。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取成年的SPF級(jí)雄性SD大鼠80只(由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，體重(280±20)g。將大鼠隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組60只，正常對(duì)照組20只。給予安靜、溫暖、光照適合、通風(fēng)良好的飼養(yǎng)環(huán)境，保持室內(nèi)溫度20℃左右，濕度設(shè)定在40%～60%，投喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，讓其自由進(jìn)食，調(diào)節(jié)光照，晝夜節(jié)律正常。

1.2主要試劑和儀器卵清蛋白(OVA，北京索萊寶科技有限公司)；氫氧化鋁干粉(沈陽化工廠)；蟲草多糖(含量90%，由云南省微生物所提供)；大鼠IL-17抗體試劑盒和大鼠IgE抗體試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；PBS漂洗緩沖液(BOSTER公司)；離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)；DW-86W100超低溫冰箱(青島海爾)；SpectraMax M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)；光學(xué)顯微鏡(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3造模方法兩組大鼠均正常適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，之后于第0天、第7天、第14天，分別給予實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射致敏劑(50 μg OVA+150 μl氫氧化鋁干粉+50 μl生理鹽水，制成混懸液)，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射；第7天，給予實(shí)驗(yàn)組大鼠皮下注射10 g/L OVA溶液，以增強(qiáng)過敏反應(yīng)，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射；第14天開始每日一次霧化吸入OVA溶液(10 g/L)，每次持續(xù)30 min，連續(xù)4 d；正常對(duì)照組予霧化吸入等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、噴嚏、不安、口唇發(fā)紺、毛發(fā)干枯等表現(xiàn)即為造模成功，實(shí)驗(yàn)組大鼠全部造模成功。

1.4實(shí)驗(yàn)方法及標(biāo)本采集造模成功后，將模型組大鼠隨機(jī)分為模型組30只和蟲草組30只。蟲草組大鼠予150 mg/kg蟲草多糖每日一次灌胃，連續(xù)14 d；模型組大鼠給予等量的生理鹽水每日一次灌胃，連續(xù)14 d；各組小鼠均正常飼養(yǎng)。造模前后及治療后，分別從各組大鼠的眼眶抽取靜脈血3 ml，利用離心機(jī)3 000 r/min離心，取上清液，分成兩部分，分別置于4℃和-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。靜脈血采集完成后，處死大鼠，迅速阻斷左側(cè)支氣管，采用PBS液對(duì)右側(cè)支氣管進(jìn)行灌洗，反復(fù)3次，抽吸收集灌洗液備用。

1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清IL-17、IgE含量取出-80℃保存的血清測定IL-17含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明書操作，將血清和試劑在室溫下放置30 min→將50 μl樣本、標(biāo)準(zhǔn)品滴加到酶標(biāo)板上→90 min后，孔內(nèi)滴加大鼠IL-17抗體工作液0.1 ml→置入37℃保溫箱中1 h→采用PBS進(jìn)行洗滌，反復(fù)3次后→滴加酶標(biāo)工作液(0.1 ml/孔)→置入37℃保溫箱中1 h→ 200 μlPBS液洗滌，反復(fù)5次→滴加50 μl顯色液TMB→培育30 min，至標(biāo)準(zhǔn)品藍(lán)染→滴加TMB終止液0.1 ml，可見藍(lán)色變?yōu)辄S色→利用450 nm酶標(biāo)儀測定光密度(OD)值→計(jì)算樣品IL-17含量。取出4℃保存的血清按照以上步驟測定血清IgE含量。

1.5.2肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞比例測定取出收集的肺泡灌洗液，利用離心機(jī)3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉渣中加入PBS液制成懸濁液，涂于載玻片上，95%乙醇固定后進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察總細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0進(jìn)行t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1治療前后各組大鼠血清IL-17水平比較實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清IL-17含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠的血清IL-17含量，與模型組(13.01±1.65)比較明顯較低(P<0.05)，見表1。

表1　治療前后各組大鼠血清IL-17、IgE水平及肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)比較( ± s)

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.05；與模型組治療后比較:2)P<0.05

2.2治療前后各組大鼠血清IgE水平比較實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IgE含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠血清IgE含量與模型組比較明顯較低(P<0.05)，見表1。

2.3各組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及嗜酸性粒細(xì)胞比例比較實(shí)驗(yàn)組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及嗜酸性粒細(xì)胞比例均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；治療后，蟲草組大鼠肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例以及嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯低于模型組(P<0.05)，見表1。

2.4哮喘大鼠血清IL-17與IgE水平的相關(guān)性哮喘大鼠血清IL-17與IgE水平呈正相關(guān)(r=0.963，P<0.01)，見圖1。

圖1　哮喘血清IL-17與IgE水平相關(guān)性

3討論

支氣管哮喘與遺傳、過敏源、環(huán)境污染等多種因素有關(guān)〔6〕，是由多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的氣道高反應(yīng)性疾病。近年來，隨著環(huán)境及生活方式的改變，支氣管哮喘的發(fā)病率不斷增加，以其發(fā)病急、臨床表現(xiàn)重、易反復(fù)等特點(diǎn)〔7〕，嚴(yán)重影響人們的生命健康和生活質(zhì)量，而目前的激素類藥物對(duì)癥治療副作用較大，臨床效果并不理想。有研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，哮喘模型大鼠體內(nèi)存在Th1/Th2細(xì)胞的失衡，Th17細(xì)胞增多，同時(shí)各種相關(guān)細(xì)胞因子含量也升高，免疫功能異常，為支氣管哮喘的治療提供了新思路。蟲草多糖提取自古老的中藥冬蟲夏草，中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草性溫，味甘，具有補(bǔ)虛損、益精氣、止咳化痰之功〔9〕，現(xiàn)代臨床研究亦證實(shí)，蟲草多糖在治療呼吸系統(tǒng)疾病、提高免疫力方面具有良好的臨床療效〔10〕。

本研究顯示，哮喘大鼠血清IL-17、IgE含量明顯高于正常大鼠；治療后，蟲草組大鼠的血清IL-17、IgE含量與模型大鼠比較明顯較低。IL-17是一種多功能的細(xì)胞因子〔11〕，能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞發(fā)育，放大氣道的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)哮喘發(fā)作；IgE可以促使嗜酸性粒細(xì)胞增多〔12〕，加重哮喘發(fā)作。IL-17和IgE起到相輔相成的作用，這與本研究結(jié)果相同。本研究結(jié)果提示蟲草多糖可以通過降低IL-17、IgE水平，從而降低哮喘反應(yīng)程度，蟲草多糖能夠使中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的含量降低，減輕炎癥反應(yīng)，這可能與其降低IL-17、IgE水平有關(guān)。

總之，蟲草多糖能夠明顯降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

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〔2013-12-21修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)