粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

肖興花

(臨沂市沂水中心醫(yī)院，山東臨沂276400)

摘要〔〕目的探討粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血組、處理組，采用稱重法測(cè)定腦組織的含水量，采用Western印跡法檢測(cè)腦組織中Bax及Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果結(jié)果：①腦水腫程度：手術(shù)后6、12、24、48 h時(shí)，腦出血組大鼠的腦組織含水量高于假手術(shù)組，治療組大鼠的腦組織含水量低于腦出血組；②Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)：腦出血組大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量低于假手術(shù)組，Bax的蛋白含量高于假手術(shù)組；治療組大鼠大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量高于腦出血組，Bax的蛋白含量低于腦出血組。結(jié)論粒細(xì)胞集落刺激因子治療能夠改善實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠的腦組織水腫程度、調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡，可能成為治療腦出血的理想方法。

關(guān)鍵詞〔〕腦出血；粒細(xì)胞集落刺激因子；凋亡分子；Bax；Bcl-2

中圖分類號(hào)〔〕R743〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：肖興花(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

腦出血是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)急癥，臨床上多采用血腫清除術(shù)進(jìn)行治療，但是患者多會(huì)殘留神經(jīng)功能損害并對(duì)日常生活造成影響。改善腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)情況是臨床研究的熱點(diǎn)。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有動(dòng)員骨髓干細(xì)胞的功能，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行修復(fù)〔1〕。Bax、Bcl-2是目前發(fā)現(xiàn)的凋亡調(diào)節(jié)蛋白因子，而細(xì)胞凋亡是被認(rèn)為引起腦出血后神經(jīng)功能缺損最重要的機(jī)制〔2〕。本研究分析了粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象成年雄性SD大鼠60只，由大學(xué)動(dòng)物中心提供。體重280～320 g，鼠齡2～3個(gè)月。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、腦出血組、治療組各20只。根據(jù)6、12、24、48 h斷頭時(shí)點(diǎn)不同分為四個(gè)亞組各5只。

1.2儀器與試劑儀器：頭顱立體定位儀由大學(xué)神經(jīng)生物實(shí)驗(yàn)室提供；電子天平：BS110S型(中國(guó)Sartorius)；顯微鏡：Olympus多功能顯微鏡(日本)；病理組織包埋機(jī)：中國(guó)BMZ-3型；臺(tái)式離心機(jī)：TGL-16G(上海)；微量注射器：世界精密儀器商貿(mào)(上海)有限公司。試劑rhG-CSF：麒麟鯤鵬(中國(guó))生物藥業(yè)有限公司；Bax、Bcl-2多克隆抗體：武漢博士德公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3處理方法腦出血組、治療組在給予10%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后以俯臥位固定，切開(kāi)頭皮后采用腦立體定位儀選擇尾狀核(前囟前0.2 mm，中線右側(cè)旁開(kāi)3 mm，深6 mm)處作為注射點(diǎn)，注入取自尾部的不凝血50 μl，而后緩慢退針，采用骨蠟局部封閉并縫合切口，采用神經(jīng)功能缺損評(píng)分，1～4分提示大鼠腦出血模型建模成功。手術(shù)后1 h，治療組腹腔注射60 μg/kg rhG-CSF，腦出血組注射等量生理鹽水。假手術(shù)組在手術(shù)造模時(shí)，用等量生理鹽水替代不凝血注射進(jìn)入顱內(nèi)，術(shù)后接受生理鹽水腹腔注射。術(shù)畢大鼠自由活動(dòng)進(jìn)食進(jìn)水。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1腦組織含水量手術(shù)后6、12、24、48 h時(shí)，采用斷頭法處死大鼠，開(kāi)顱取出腦組織，取出腦膜、低位腦干和小腦組織，保留大腦組織并用電子天平稱量濕重，而后將腦組織放在恒溫電烤箱中100℃烘烤24 h，使水分充分蒸發(fā)，而后用電子天平稱量干重。參照Elliott公式計(jì)算腦組織含水量，含水量為(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.2腦組織中Bax、Bcl-2蛋白含量檢測(cè)取腦組織，加入RIPA裂解液抽提蛋白，采用Western印跡檢測(cè)蛋白含量，設(shè)定手術(shù)后6 h時(shí)假手術(shù)組的蛋白含量為100，計(jì)算其他時(shí)間點(diǎn)、其他組蛋白含量的相對(duì)值。

2結(jié)果

2.1腦組織含水量經(jīng)方差分析，三組間腦組織含水量有差異(P<0.05)；LSD兩兩比較顯示，腦出血組大鼠的腦組織含水量高于假手術(shù)組，治療組大鼠的腦組織含水量低于腦出血組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2腦組織Bcl-2、Bax的蛋白含量三組間腦組織Bcl-2的蛋白含量有差異(P<0.05)；腦出血組大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量低于假手術(shù)組；Bax蛋白含量高于假手術(shù)組治療組大鼠大鼠腦組織Bcl-2的蛋白含量高于腦出血組，Bax含量低于腦出血組(均P<0.05)。見(jiàn)表2，表3。

表1　三組大鼠腦組織含水量比較

表2　三組大鼠腦組織Bcl-2的蛋白比較

表3　三組大鼠腦組織Bax的蛋白比較

3討論

rhG-CSF能夠動(dòng)員骨髓干細(xì)胞(BMSC)向腦損傷部位遷移并在局部對(duì)壞死的腦組織進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)〔3〕。BMSC在神經(jīng)系統(tǒng)局部能夠產(chǎn)生成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞在局部完成黏附、增殖、分化的過(guò)程，有利于神經(jīng)功能的修復(fù)〔4〕；同時(shí)，BMSC也能產(chǎn)生神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，有利于腦出血局部血供重建、神經(jīng)功能的恢復(fù)〔5〕。此外，由rhG-CSF動(dòng)員而募集的BMSC具有抗炎的作用，能夠減輕局部神經(jīng)細(xì)胞所受到的損傷〔6〕。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道了rhG-CSF治療腦血管疾病的價(jià)值，通過(guò)動(dòng)員BMSC保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞、修復(fù)神經(jīng)功能、緩解腦組織局部水腫〔7〕。腦組織水腫是腦出血后最重要的病理改變，也是造成神經(jīng)功能損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)稱量腦組織的干重和濕重并計(jì)算差值可以反映腦組織的水腫程度〔8〕。本研究說(shuō)明腦出血模型建立后腦組織發(fā)生水腫，而在進(jìn)行rhG-CSF治療后能夠改善腦組織水腫的情況，有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

細(xì)胞凋亡是一種基本的生理現(xiàn)象，對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要價(jià)值，具體是指細(xì)胞在內(nèi)外環(huán)境刺激因素作用下發(fā)生的自主有序的死亡過(guò)程。該過(guò)程有助于清除體內(nèi)異常的細(xì)胞并且受到了多種基因的調(diào)控。Bcl家族是體內(nèi)重要的凋亡調(diào)控基因，包括了抗凋亡基因和促凋亡基因兩大類型，前者的代表是Bcl-2，主要通過(guò)作用于線粒體細(xì)胞色素C來(lái)發(fā)揮抗凋亡的作用〔9〕；后者的代表是Bax，通過(guò)與Bcl-2形成異源二聚體來(lái)阻斷Bcl-2的抗凋亡作用，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的程序〔10〕。此外，Bcl-2還具有神經(jīng)保護(hù)功能，可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧自由基以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的損傷〔11〕。

在腦出血的發(fā)生過(guò)程中，腦組織血供中斷且受到局部血腫的壓迫，會(huì)激活細(xì)胞凋亡的程序，使神經(jīng)功能發(fā)生損傷。在本研究中，通過(guò)分析假手術(shù)組和腦出血組大鼠腦組織中凋亡調(diào)節(jié)分子的表達(dá)量，進(jìn)一步說(shuō)明腦出血大鼠模型建立成功，血腫周圍組織中細(xì)胞發(fā)生凋亡；而腦出血大鼠在接受rhG-CSF治療后，血腫周圍組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程受到抑制，有利于神經(jīng)細(xì)胞的增殖以及神經(jīng)功能的重建。

本文研究表明，粒細(xì)胞集落刺激因子治療能夠改善實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠的腦組織水腫程度、調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡，可能成為治療腦出血的理想方法。由于自身能力及實(shí)驗(yàn)條件的限制，本文難以深入提示粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)腦出血大鼠血腫周圍組織中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)影響的作用機(jī)制，有待于更多的臨床與實(shí)驗(yàn)研究去探索。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)