MicroRNA-126對人正常肝細胞株脂代謝的影響

胡志為何亞非劉艷霞栗夏蓮

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討循環(huán)中MicroRNA-126在1型和2型糖尿病影響肝細胞的糖代謝及對正常肝細胞系Chang liver細胞脂代謝的影響。方法以人正常肝細胞系為對象，設置MicroRNA-126 mimics轉(zhuǎn)染組、MicroRNA-126 inhibitor轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、陰性對照抑制組、轉(zhuǎn)染試劑組與正常對照組。通過轉(zhuǎn)染MicroRNA-126類似物及拮抗物，改變MicroRNA-126表達。RT-PCR法檢測各組細胞中MicroRNA-126的表達量；轉(zhuǎn)染MicroRNA序列48 h后，繼而胰島素作用12 h，甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)定量檢測試劑盒檢測每組肝細胞內(nèi)TG和TC的含量。結果RT-PCR結果顯示MicroRNA-126 mimics轉(zhuǎn)染組較正常對照組的MicroRNA-126 表達量顯著增加(t=26.18，P<0.05)，其余各組較正常對照組的MicroRNA-126表達量則無顯著差別(P=0.609)。胰島素作用后，MicroRNA-126 mimics轉(zhuǎn)染組、MicroRNA-126 inhibitor轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、陰性對照抑制組、轉(zhuǎn)染試劑組與正常對照組相比，TG和TC含量無顯著差別(F=1.074，0.436，均P>0.05)。結論MicroRNA-126對正常肝細胞株TG及TC的代謝可能沒有影響。

關鍵詞〔〕MicroRNA-126；人正常肝細胞株；脂代謝

中圖分類號〔〕R39〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河南省衛(wèi)生廳省部共建項目(No.201201015)

通訊作者：栗夏蓮(1961-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事內(nèi)分泌代謝疾病診斷治療研究。

第一作者：胡志為(1988-)，女，碩士，主要從事內(nèi)分泌代謝疾病診斷治療研究。

MicroRNAs對自身穩(wěn)態(tài)和疾病的發(fā)生有著重要的影響〔1〕，可以和靶信使RNA(mRNA) 的非編碼區(qū)(-UTRs)結合，抑制編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄后表達〔2〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs與2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，糖尿病病人血漿中MicroRNA-126的表達明顯降低，動物模型也得到了驗證〔3〕。前期工作證實MicroRNA-126可促進糖異生并且降低葡萄糖的利用率。糖尿病是一種糖脂病，肝臟在糖脂代謝中起重要作用。本實驗通過對正常肝細胞轉(zhuǎn)染MicroRNA-126類似物，測定轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)甘油三酯(TG)及膽固醇(TC)的含量，旨在探討MicroRNA-126對肝細胞脂代謝功能的影響。

1材料與方法

1.1材料和試劑人正常肝細胞系Chang liver由我院臨床藥學實驗室饋贈；胎牛血清購自四季青公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；MicroRNA-126類似物等核苷酸片段由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen 公司；RNAiso for small RNA試劑、 PrimeScript RT reagent Kit均購自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄和熒光實時定量PCR檢測所用引物由廣州銳博公司提供；TG、TC檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗方法

1.2.1Chang liver細胞的培養(yǎng)液氮中取出Chang liver細胞，37℃快速解凍，放入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃ 、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。

1.2.2最佳轉(zhuǎn)染條件的篩選取對數(shù)生長期細胞以適宜密度接種于24孔板，細胞生長至70%時，用無血清無抗生素培養(yǎng)基孵育4 h，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染不同濃度熒光標記的無意對照序列(FAM-NC及inhibitor FAM-NC)(20、40、80 nmol/L)，6 h后通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光的強度來確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。

1.2.3人工合成RNA轉(zhuǎn)染及細胞內(nèi)MicroRNA-126檢測選取適宜MicroRNA序列轉(zhuǎn)染濃度(80 nmol/L)，轉(zhuǎn)染步驟同上，提取細胞內(nèi)RNA。Prime Script RT reagent Kit 進行RT-PCR，20 μl體系中包括1 μl RNA 模板，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA 為模板，分別對每組細胞中MicroRNA-126和U6內(nèi)參進行實時熒光定量PCR擴增。廣州銳博公司提供逆轉(zhuǎn)錄和熒光實時定量PCR檢測所用引物，產(chǎn)品編號為：has-miR-126-3p RT primer：15373.60；has-miR-126-3p Forward primer：9641.02；has-miR-126-3p Reverse primer：10239.41；U6 RT Primer：6092.02；U6 Forward primer：5131.39；U6 Reverse primer：6092.02。cDNA第一鏈反應條件：42℃，1 h；70℃，10 min；PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s；60℃退火20 s；70℃延伸30 s，擴增45個循環(huán)。Ct比較法計算目的基因轉(zhuǎn)錄水平(2-ΔΔCt)。

1.2.4細胞內(nèi)TG、TC含量的測定細胞轉(zhuǎn)染48 h后用胰島素處理12 h，胰酶消化細胞，將細胞懸液取出，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，1 000 r/min離心10 min，棄上清，留細胞沉淀，加入200 μl PBS液，冰水浴條件下超聲破碎，制備好的勻漿液不離心待測，按空白組，校準組，樣品組分別加樣，混勻后37℃孵育5 min，可見光分光光度計500 nm波長處檢測各組吸光度值，BCA法進行蛋白定量，計算每毫克蛋白對應的TG和TC的含量，以排除細胞數(shù)的影響，每個樣品設3個復孔。

2結果

2.1肝細胞最佳轉(zhuǎn)染條件的篩選細胞生長至70%后，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染不同濃度(20、40、80 nmol/L)的熒光標記的無意對照序列(FAM-NC及inhibitor FAM-NC)，6 h后熒光顯微鏡下觀察細胞中的綠色熒光，F(xiàn)AM-NC及inhibitor FAM-NC可以有效的轉(zhuǎn)染細胞，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖1。

A：FAM-NC 20 nmol/L；B：FAM-NC 40 nmol/L；C：FAM-NC 80 nmol/L；D：inhibitor FAM-NC 20 nmol/L；E：inhibitor FAM-NC 40 nmol/L；F：inhibitor FAM-NC 80 nmol/L 圖1　熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光(　　　)

2.2細胞內(nèi)MicroRNA-126的檢測MicroRNA-126 mimics轉(zhuǎn)染組細胞中MicroRNA-126 的相對表達量(789.67±65.77)較正常對照組(設為1.00)顯著增加(t=26.18，P<0.05)；MicroRNA-126 inhibitor轉(zhuǎn)染組(0.87±0.23)、陰性對照組(1.04±0.08)、陰性對照抑制組(1.00±0.17)、轉(zhuǎn)染試劑組(0.87±0.35)及正常對照組MicroRNA-126表達量之間的差異無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.609)。

2.3Chang liver細胞內(nèi)TG及TC含量的變化正常對照組細胞經(jīng)胰島素處理后，TG及TC含量明顯增加〔TG：(337.60±33.23)mg/g蛋白 vs (173.60±18.04)mg/g蛋白；TC：(309.67±60.90)mg/g蛋白 vs (144.81±7.56)mg/g蛋白〕(t=10.76，P<0.01)，證明細胞對胰島素的脂代謝作用反應良好。胰島素作用后，MicroRNA-126 mimics轉(zhuǎn)染組〔TG：(383.89±56.43)mg/g蛋白，TC：(352.88±44.99)mg/g蛋白〕、MicroRNA-126 inhibitor轉(zhuǎn)染組〔TG:(353.80±43.89)mg/g蛋白，TC：(329.53±49.89)mg/g蛋白〕、陰性對照組〔TG:(336.84±42.30)mg/g蛋白，TC：(343.41±34.45)mg/g蛋白〕、陰性對照抑制組〔TG:(348.93±31.11)mg/g蛋白，TC：(334.26±64.11)mg/g蛋白〕、轉(zhuǎn)染試劑組〔TG:(347.17±36.47)mg/g蛋白，TC：(339.52±70.25)mg/g蛋白〕與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(F=1.074，0.436，均P>0.05)。

3討論

肝臟是脂代謝的重要器官，也是胰島素作用的重要靶點，胰島素可以促進脂質(zhì)的合成和存儲，促進脂肪酸進入細胞，增加脂質(zhì)合成酶類的表達〔4〕，肝臟胰島素抵抗是機體脂代謝紊亂的重要原因之一。

MicroRNA-126在內(nèi)皮細胞及凋亡小體中含量非常豐富，影響血管新生、干細胞發(fā)育、細胞凋亡等〔5〕，但近年研究發(fā)現(xiàn)其與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展也有著密切的聯(lián)系，國內(nèi)外研究表明糖尿病病人血漿中MicroRNA-126的含量較正常人群均降低〔3，6〕。前期實驗發(fā)現(xiàn)MicroRNA-126可以明顯減少人正常肝細胞中胰島素受體底物-1(IRS-1)蛋白的表達，而肝臟的胰島素抵抗和胰島素受體底物IRS-1、IRS-2表達量減少相關，在糖尿病病人及動物模型中這兩種蛋白的表達往往是下調(diào)的〔7，8〕，這些胰島素信號的表達缺陷常導致糖脂代謝的異常。

在IRS/PI3K/AKT胰島素信號傳導通路中，胰島素通過IRS-1激活了磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)，引起下游Akt及GSK-3等糖代謝酶類的激活〔4〕，這與之前的研究也相符，而細胞的脂代謝途徑則是通過IRS-2調(diào)控脂肪合成相關酶類〔9〕，從而引起細胞脂代謝的變化。

通過本實驗結果猜測MicroRNA-126對肝細胞脂代謝無影響。同時國外研究表明，單獨抑制IRS-1的表達并不影響膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白(SREBP1c)及Fasn等脂肪合成關鍵基因的表達，而IRS-2表達下降會引起Srebf1c表達上調(diào)，當同時抑制肝臟IRS-1和IRS-2，SREBP和Fasn的表達顯著增加。同時抑制兩種蛋白的小鼠肝臟中TG的含量較正常小鼠高出3倍以上，然而相比之下，抑制單一蛋白的小鼠肝臟中TG的增加量則不甚明顯〔9〕。Bouzakri等〔10〕在人骨骼肌細胞中運用RNA干擾技術證明，在IRS-1蛋白表達下調(diào)的情況下，胰島素刺激下的棕櫚酸攝取量相較正常組沒有明顯改變，細胞的β氧化作用下降〔10〕。而IRS-2則是通過調(diào)控脂肪合成的酶類來維持脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)，此結果也在敲除IRS-1和IRS-2的動物模型上得到驗證〔11〕，與本實驗結果相符。綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，IRS-1的功能和葡萄糖的穩(wěn)態(tài)聯(lián)系的更加密切，而IRS-2則更加密切聯(lián)系于脂類代謝〔11〕，并且之前的研究發(fā)現(xiàn)，不同階段T2DM患者循環(huán)MicroRNA-126水平和TC、TG含量并無相關性〔12〕。

綜上所述，推測MicroRNA-126可能不是通過IRS-1/PI3K途經(jīng)影響人正常肝細胞的脂代謝功能，其具體的分子作用機制還有待于進一步研究。

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〔2014-02-17修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)