CXCR2-siRNA重組質(zhì)粒治療宮頸癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

楊澤宇王鋼1許曉茵2

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院超聲科，遼寧沈陽(yáng)110004)

摘要〔〕目的研究趨化因子受體CXCR2的siRNA質(zhì)粒構(gòu)建及對(duì)裸鼠移植宮頸癌的抑制作用。方法將通過(guò)人源CXCR2的基因序列設(shè)計(jì)的siRNA和質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6通過(guò)內(nèi)切酶鏈接，同時(shí)引入膽固醇修飾，將重組質(zhì)粒免疫建立好的裸鼠模式動(dòng)物，通過(guò)測(cè)算評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒的治療效果。結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒大小正確，濃度合適；經(jīng)過(guò)28 d的治療，空白對(duì)照組和空質(zhì)粒對(duì)照組腫瘤體積生長(zhǎng)比較無(wú)差異(P>0．05)；重組質(zhì)粒治療組的效果明顯，與前兩組比較差異顯著(P<0．01)，并且重組質(zhì)粒治療組的抑瘤率達(dá)到50%；熒光顯微鏡觀察增強(qiáng)綠色熒光信號(hào)，產(chǎn)生熒光的細(xì)胞約占總細(xì)胞的8%，體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果明顯。結(jié)論經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的重組質(zhì)粒對(duì)趨化因子受體的表達(dá)具有抑制作用，在裸鼠模式動(dòng)物治療效果中具有重要意義。

關(guān)鍵詞〔〕siRNA；CXCR2；宮頸癌；裸鼠移植腫瘤

中圖分類號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科

2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院外科

第一作者：楊澤宇(1977-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科疾病診斷、產(chǎn)前篩查相關(guān)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究。

CXCR2屬于G蛋白相關(guān)受體超家族，與趨化因子超家族CXC亞家族成員白細(xì)胞介素(IL)-8具有高度特異性和親和力。近年來(lái)研究表明趨化因子受體在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中起重要作用，腫瘤細(xì)胞表面受體中CXCR2與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔1，2〕。RNA干擾(RNAi)是在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，能特異、高效地沉默靶標(biāo)基因。siRNA可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)特定基因產(chǎn)生具有專一性的抑制表達(dá)效果〔3～5〕。目前，RNAi已經(jīng)成為研究基因功能的有效方法，并且RNAi技術(shù)具有高效性和特異性，極有可能發(fā)展成為特異性治療腫瘤的手段。

1材料與方法

1.1siRNA序列和載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中人源CXCR2基因序列，使用軟件siRNA Target Finder設(shè)計(jì)siRNA序列，該軟件由Ambion公司提供。CXCR2-siRNA序列為：正義5′GAACAAAUUUACAGAGACAUU3′；反義3′UUCUUGUUUAAAUGUCUCUGU(5′-P)5′；同時(shí)在其序列中引入內(nèi)切酶位點(diǎn)：正向5′-AAGCTT-3′；反向5′-GGATCC-3′。siRNA由上海生工生物科技有限公司合成。

載體的選擇：使用腺病毒載體siRNA穿梭質(zhì)粒：pDC316-EGFP-U6，購(gòu)自于北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司，其啟動(dòng)子是人U6啟動(dòng)子，同時(shí)表達(dá)EGFP。使用內(nèi)切酶位點(diǎn)BamH Ⅰ(位于2017) 和Hind Ⅲ(位于：1997)進(jìn)行基因的鏈接。

鏈接反應(yīng)：反應(yīng)體系為CXCR2-siRNA 2 μl(約200 ng)；Vector DN(pDC316-EGFP-U6) 1 μl(約50 ng)；H2O 2 μl；Ligation Solution1 5 μl。反應(yīng)條件為：16℃，10h。鏈接反應(yīng)使用TaKaRa公司鏈接試劑盒完成。

1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌將連接好的重組質(zhì)粒液10 μl全量轉(zhuǎn)化至E.coli JM109 Competent Cell(TaKaRa Code No.D9052)，轉(zhuǎn)化過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化后涂在含氨芐抗性的LB培養(yǎng)板，4℃培養(yǎng)16 h，挑選氨芐抗性陽(yáng)性單菌落。提取陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序確定篩選到的質(zhì)粒為插入CXCR2-siRNA的重組質(zhì)粒，命名為：pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA。按菌液∶甘油(高壓滅菌)1∶1的比例將菌種凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA的大量制備將含重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA的菌株接種于500 ml LB氨芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，18 h后進(jìn)行質(zhì)粒的大規(guī)模提取，使用質(zhì)粒提取試劑盒Qiagen?？召|(zhì)粒pDC316-EGFP-U6的大量制備按照相同的方法進(jìn)行。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒。

1.4重組質(zhì)粒的膽固醇修飾脂質(zhì)體購(gòu)自于上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司。用吡咯烷做連接劑，在重組質(zhì)粒的SV40 ployA位點(diǎn)連接上膽固醇得到chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。

圖1　重組質(zhì)粒基因插入結(jié)構(gòu)圖

1.5裸鼠動(dòng)物模型的建立5～6周齡健康免疫缺陷BALB/c裸鼠18只，雌雄各半，SPF級(jí)，體重(12±2)g，購(gòu)自北京生物梅里埃公司。喂養(yǎng)于嚴(yán)格消毒的無(wú)菌層流動(dòng)物房?jī)?nèi)，環(huán)境溫度維持在25℃，空氣濕度維持在50%～70%，飼料和水經(jīng)消毒處理后自由進(jìn)食。

人宮頸癌Hela細(xì)胞復(fù)蘇后，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌Hela細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.8×107/ml，于每只裸鼠右前肢腋下皮下接種0.3 ml細(xì)胞懸液，接種后每天觀察注射點(diǎn)成瘤情況，以皮下結(jié)節(jié)體積達(dá)50 mm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。

1.6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)18只裸鼠移植瘤在接種后第14天均達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率為100%，稱重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、空質(zhì)粒對(duì)照組、重組質(zhì)粒治療組，每組6只。詳細(xì)記錄瘤體體積及裸鼠體重變化，測(cè)量及體積計(jì)算方法〔6，7〕：在成瘤后第1、5、9、13、17、21、25天用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)短徑(a、b)；腫瘤體積V(mm3)=a×b2/2；抑瘤率(%)=(1-治療組V/對(duì)照組V)×100%。

裸鼠成瘤后第1、4、7、10、13、16、19、21天進(jìn)行多點(diǎn)瘤內(nèi)原位注射，使用分光光度計(jì)測(cè)定重癥質(zhì)粒的OD260值，按照1 OD=50 μg/ml換算，每只小鼠注射chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA量為0.10 mg。

治療結(jié)束后第2天數(shù)據(jù)采集后處死裸鼠，部分腫瘤組織用10%甲醛固定，部分腫瘤組織儲(chǔ)存在液氮中備用。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)將試劑盒大規(guī)模提取的質(zhì)粒通過(guò)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其大小正確，濃度合適。見(jiàn)圖2。

圖2　3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒

2.2裸鼠人宮頸癌移植瘤的生長(zhǎng)抑制各實(shí)驗(yàn)組均于接種細(xì)胞6 d后可觸及瘤體結(jié)節(jié)，2 w后均達(dá)到實(shí)驗(yàn)需要的成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率為100%。經(jīng)過(guò)28 d的治療，空白對(duì)照組和空質(zhì)粒對(duì)照組腫瘤體積〔(1 529.51±23.44)mm3vs (1 499.83±36.58)mm3〕比較無(wú)差異(P>0．05)；14 d時(shí)重組質(zhì)粒治療組〔(836.27±53.19)mm3〕與前兩組比較差異顯著(P<0.01)。28 d時(shí)，重組質(zhì)粒治療組抑瘤率(50%)與其他各組(均0%)比較差異顯著(P<0.01)。

2.3光鏡觀察結(jié)果取部分腫瘤組織做常規(guī)病理切片，經(jīng)重組質(zhì)粒治療后的腫瘤組織切片見(jiàn)癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、凋亡細(xì)胞形成；而空白對(duì)照組和空質(zhì)粒對(duì)照組的腫瘤組織切片可見(jiàn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)良好，核分裂相多見(jiàn)。重組質(zhì)粒治療組荷瘤裸鼠的肺、肝臟、腎臟組織病理切片顯示正常表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。

2.4移植瘤組織中EGFP熒光信號(hào)的檢測(cè)經(jīng)過(guò)重組質(zhì)粒治療后，將裸鼠腫瘤組織用10%甲醛固定，熒光電鏡下觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP熒光信號(hào)。觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤組織出現(xiàn)綠色熒光，產(chǎn)生熒光的細(xì)胞約占總細(xì)胞的8%，說(shuō)明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到周圍腫瘤組織，穩(wěn)定表達(dá)外源的EGFP。見(jiàn)圖3。

圖3　熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒治療組腫瘤組織中 EGFP熒光信號(hào)

3討論

宮頸癌是女性第二大常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期可發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，且近年發(fā)現(xiàn)有年輕化趨勢(shì)。宮頸癌治療早期以手術(shù)為主、輔以放化療，晚期放療為主、輔以化療，但仍然需要補(bǔ)充新療法，其中基因治療被認(rèn)為是最有前途和挑戰(zhàn)性的研究方向之一，而目前基因治療的研究熱點(diǎn)是RNAi技術(shù)。siRNA分子是RNAi過(guò)程中的中間產(chǎn)物，通常是一段長(zhǎng)20～25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，雙鏈分別在RNA 3′端超出另一端兩個(gè)核苷酸，這種結(jié)構(gòu)是DICER酶處理而來(lái)。siRNA可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)特定基因產(chǎn)生具有專一性的抑制表達(dá)效果。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種設(shè)計(jì)是可行有效的〔5～9〕。

在穿梭質(zhì)粒載體上的選擇上，本研究選擇腺病毒載體siRNA穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6。該質(zhì)粒以pDC316質(zhì)粒為骨架改造，啟動(dòng)子是人U6啟動(dòng)子，為在人類宮頸癌基因治療中的應(yīng)用提供前提準(zhǔn)備。同時(shí)表達(dá)EGFP，便于示蹤和估計(jì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。另外，該質(zhì)粒包括多種抗性基因，便于平板篩選陽(yáng)性克隆。包括SV40ployA，有利于后續(xù)加工和修改。

EGFP是熒光分子，它的熒光強(qiáng)度是綠色熒光蛋白(GFP)的35倍，通過(guò)熒光顯微鏡能夠觀察重組質(zhì)粒的傳染效率。在細(xì)胞質(zhì)中有104個(gè)或細(xì)胞表面有2×103個(gè)EGFP分子時(shí)，即可被流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)到。因此，另可以直接用于檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。

基因的靶向治療中，由于組織或血液中存有大量的核酸酶，會(huì)直接導(dǎo)致RNA藥物分子的迅速降解，使得RNAi機(jī)制喪失或藥效丟失。所以如何有效解決裸RNA藥物分子在血液中的穩(wěn)定性十分關(guān)鍵〔6～10〕。 一般的解決方案包括：化學(xué)修飾RNA分子二甲基化修飾或膽固醇修飾等；利用功能高分子或脂質(zhì)體載體包裹裸RNA藥物分子。本研究中一是選擇膽固醇修飾，用吡咯烷做連接劑，在重組質(zhì)粒的SV40 ployA位點(diǎn)連接上膽固醇得到chol-pDC316-EGFP-U6-CXCR2-siRNA；另外，使用聚乙烯吡咯烷酮(分子量6 000的PVP)修飾脂質(zhì)體。聚乙烯吡咯烷酮作為一種兩親性聚合物，具有良好的生物相容性，可用作脂質(zhì)體立體保護(hù)劑。這樣不僅解決了RNA藥物分子在組織中的穩(wěn)定性，也可以解決RNA藥物分子在全身傳輸中的組織器官靶向性難題，使其能夠到達(dá)指定腫瘤組織中發(fā)揮抑制作用。本研究為siRNA基因靶向治療宮頸癌提供了研究基礎(chǔ)。

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〔2014-09-15修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)