甘草提取物對氧化應激損傷黑素細胞的影響

黎雯

(海南省皮膚性病防治中心皮膚外科，海南海口570206)

摘要〔〕目的探討甘草提取物對體外培養(yǎng)黑素細胞氧化應激的影響。方法從正常人包皮分離培養(yǎng)黑素細胞，用甘草提取物處理培養(yǎng)的黑素細胞，處于過氧化氫培養(yǎng)基中。結果過氧化氫組黑素細胞活力顯著下降(P<0.05)；甘草提取物組黑素細胞活力濃度依賴性地有所提高(P<0.05)。結論甘草提取物可抑制黑素細胞，控制氧化應激反應。

關鍵詞〔〕黑素細胞；甘草提取物

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：黎雯(1974-)，女，主治醫(yī)師，主要從事變態(tài)反應研究。

中醫(yī)認為甘草，具有補脾益氣，祛痰止咳，緩急止痛，清熱解毒，調和諸藥的功效。西醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)甘草具有抗炎、抗變態(tài)反應、抗氧化、殺菌和美白的作用〔1〕。甘草的化學組成極為復雜，主要成分為甘草甜素和甘草次酸。近年來，研究發(fā)現(xiàn)甘草有抗氧化的作用，為進一步研究甘草對人表皮黑素細胞的調控作用〔1〕。我們首先體外分離、培養(yǎng)人正常人表皮黑素細胞〔2〕，建立黑素細胞氧化應激模型，并觀察黑素細胞增殖情況，以探討其可能的作用機制。

1材料和方法

1.1實驗藥品甘草提取物購于中國藥品生物制品檢定所。使用前，先用DMSO溶解，配成母液(濃度100 g/L)，放置于-20℃冰箱低溫保存。實驗過程中用新鮮培養(yǎng)基調至終濃度。

1.2主要試劑的配制M254培養(yǎng)基(美國Cascade公司)；MTS(美國Promega公司)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國Gibco公司)；DMSO(美國Sigma公司)人黑素細胞生長添加劑HMGS(美國Cascade公司)；0.25% EDTA胰蛋白酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；Dispase分離酶(美國羅氏試劑公司)。

1.3細胞來源實驗中所需細胞取至正常青年男性包皮術后留下的病理組織，實驗前，應征求患者本人同意，同意后方可進行實驗，符合倫理學要求。

1.4實驗方法

1.4.1實驗分組實驗中共設立5個分組，空白對照組為完全培養(yǎng)基，添加黑色素培養(yǎng)；過氧化氫組中為過氧化氫培養(yǎng)基，濃度保持在0.4 mmol/L；甘草提取物組中為甘草提取物培養(yǎng)基，保持濃度為10-8mol/L，每組在培養(yǎng)過程中保留復孔4個；實驗組中再次分為3組，加入2.5 mg/L 5.0 mg/L及10.0 mg/L甘草提取液組，隨后將3個甘草提取物組分別添加至過氧化氫培養(yǎng)基，培養(yǎng)基濃度保持在0.4 mmol/L。

1.4.2分離人表皮黑素細胞首先將正常青少年男性包皮組織置于75%的酒精溶液中浸泡約10 min，然后用PBS緩沖液沖洗包皮組織6～10遍〔3〕；再使用眼科剪剔除組織皮下脂肪組織，并再次用PBS液沖洗5～6次。將組織剪1.5 mm×1.5 mm的方形組織塊，平鋪在培養(yǎng)皿中(真皮朝向培養(yǎng)皿底部)；組織中加入Dispase分離酶3～5 ml，放入4℃冰箱中16 h，后轉移入恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h；用眼科剪剔除真皮，留下表皮。使用PBS沖洗組織2～3次，室溫下0.25%胰蛋白酶消化5 min，隨后加入10% FBS終止消化，吹打組織，制成黑素細胞懸液，隨后用200目細胞篩過濾，并低速離心(1 200 r/min)3 min，隨后記錄細胞數(shù)量，在無菌培養(yǎng)瓶中，濃度保持在5×104/ml左右，培養(yǎng)瓶中均加入4 ml M254，處于二氧化碳的環(huán)境中恒溫培養(yǎng)，溫度保持在37℃左右。培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)液，以后每隔2～3 d換液1次，方法同文獻〔3〕。

1.4.3人表皮黑素細胞的鑒定(L-DOPA染色法)取第三代人表皮黑素細胞，與1 ml的胰蛋白酶充分混合，濃度為0.25%。暫停消化過程，使黑素細胞保持在1×104/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中，然后置于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后加入已預熱至37℃的4%多聚甲醛固定細胞25 min，然后雙蒸水洗3次。將細胞蓋玻片置于L-DOPA染色液中，嚴格檢測染色情況，每半小時檢測一次，3 h染色完成，得到棕色樣品，進行漂洗脫水處理，封裝成片。

1.4.4建立人表皮黑素細胞氧化應激模型在黑素細胞停留在對數(shù)生長時期，取出樣品進行實驗，使用PBS液進行清洗，待清洗干凈后，與1 ml胰蛋白酶均勻混合，胰蛋白酶濃度為0.25%為宜，將混合液置于常溫中3 min，取混合液中懸液，使?jié)舛缺３衷?.5×105/ml，取96孔培養(yǎng)板，于上進行實驗培養(yǎng)，37℃恒溫狀態(tài)。在5%CO2的環(huán)境中進行24 h的培養(yǎng)，觀察細胞均附于細胞壁上后，將其與培養(yǎng)基分離，從復孔中對甘草提取物組中添加不同濃度的甘草提取物(2.5、5.0、10.0 mg/L)100 μl。其余組僅予以完全培養(yǎng)基環(huán)境，在恒溫二氧化碳的條件下進行培養(yǎng)24 h，對黑素細胞的形態(tài)學改變做出記錄比較，進行染色，原環(huán)境下延續(xù)4 h培養(yǎng)結束。MTS法檢測各組細胞活力。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1人表皮黑素細胞鑒定結果(L-DOPA染色法)染色后，可見樣本呈黑色或棕褐色，說明反應呈陽性，驗證為黑素細胞。見圖1。

2.2甘草提取物對過氧化氫誘導下人表皮黑素細胞活力的影響(MTS法)過氧化氫組的黑素細胞活力降低顯著較空白對照組明顯降低〔(44.348±1.052)% vs (97.775±0.445)%，P<0.05〕，2.5、5.0、10、0 mg/L甘草提取物分別提高一定程度的黑素細胞活力〔(45.079±1.380)%、(47.891±1.466)%、(57.496±2.419)%，P<0.05〕，但仍低于空白對照組(P<0.05)。

圖1　L-DOPA染色陽性人表皮黑素細胞(×200)

3討論

甘草的化學組成極為復雜，目前為止從甘草中分離出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草甙、異甘草甙、新甘草甙等數(shù)十種化合物，但其中的主要成分為甘草甜素和甘草次酸。中醫(yī)學認為，甘草味甘，性平，具有解毒清熱，補氣健脾的功效，現(xiàn)代醫(yī)學認為，甘草可對咳嗽、口腔潰瘍和胃潰瘍有明顯的治療作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)甘草有抑制黑素細胞酪氨酸酶和黑素瘤細胞黑素合成的作用。黑素細胞由神經(jīng)嵴發(fā)出，共經(jīng)過3發(fā)育階段成型。胚胎發(fā)育期，在家族整合素的影響下，所有細胞均處在遷徙過程中，胚胎細胞在次過程中可直接發(fā)育成黑素細胞，并自動找尋生長位置〔4〕。生活中，一些皮膚炎癥可造成黑素細胞大量沉積，從而導致曬傷和雀斑等〔5〕。黑素細胞的集聚和遷徙，與炎癥的消退、切口的愈合和腫瘤細胞的擴散有直接聯(lián)系，對患者病情的發(fā)展產(chǎn)生直接的影響〔6〕。

氧化應激反應在適當?shù)膹姸认驴蓪C體有促進作用，若超過適當?shù)姆秶l(fā)生氧化應激反應，則可導致機體細胞大量死亡，對機體造成嚴重的額損傷。活性氧(ROS)可評定機體內的氧化應激程度。過氧化氫可提高ROS，當機體內的ROS量較高時，則認為大量細胞與蛋白質超負荷運轉而死亡。本研究發(fā)現(xiàn)甘草提取物一定程度上劑量依賴性提高黑素細胞的活力，我們將在今后的試驗中擴大甘草提取物濃度范圍，以全面、系統(tǒng)地分析其對黑素細胞調控作用。Liu等〔7〕通過實驗探究保護黑素細胞的過程中發(fā)現(xiàn)，若使用黃芩黃素對黑素細胞處理后，進行過氧化氫處理，隨后觀察ROS，發(fā)現(xiàn)ROS水平普遍升高，且黃芩黃素的濃度越高，ROS水平越低，對我們實驗的結果進行了充分驗證。

本實驗說明，甘草提取物可提高機體內的ROS，對氧化應激反應的程度進行調控，進而影響細胞的死亡情況。由此可猜測甘草提取物是一種機體自身產(chǎn)生的保護氧化應激反應的物質。但目前對反應機制以及過程未能了解清楚，希望以后可進行相關實驗，探究甘草提取物的作用機制以及調控氧化應激反應的原理，為化妝品及藥物的研發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

4參考文獻

1Vaya J，Belinky PA，Aviram M.Antioxidant constituents from licorice roots：isolation，structure elucidation and antioxi dative capacity toward LDL oxidation〔J〕.Free Radical Biol Med，1997；23(3):302-13.

2Yokota T，Nishio H，Kubota Y，etal.The inhibitory effect of abridin from licorice extracts oll melanogenesis and inflammation〔J〕.Pigment Cell Res,1998;11(6)：355-61.

3張迪敏，洪為松，傅麗芳，等.個體化培養(yǎng)自體黑素細胞移植治療白癜風〔J〕.中華皮膚科雜志，2010;43(10)：721-5.

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6Aguino A，F(xiàn)ormica V，Preto SP,etal.Drug-induced increase of carcinoembryonic antigen expression in cancer cells〔J〕.Pharmacol Res，2004;49(5)：383-96.

7Liu B，Jian Z，Li Q，etal.Baicalein protects human melanocytes from H2O2-induced apoptosis via inhibiting mitochondria-dependent caspase activation and the p38 MAPK pathway〔J〕.Free Radic Biol Med，2012;53(2)：183-93.

〔2013-12-18修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)