基于p38MAPK通路探討疏肝健脾方藥含藥血清對LPS刺激下大鼠Kupffer細胞炎癥損傷保護作用的機制

韓莉李媛媛1楊欽河1張玉佩1梁蔭基1李樹成龔享文王觀龍1張金文1林春梅1金玲王攀攀

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510632)

摘要〔〕目的基于p38MAPK通路探討疏肝健脾方藥含藥血清對脂多糖(LPS)刺激大鼠Kupffer細胞炎癥損傷的保護作用。方法體外培養(yǎng)并鑒定SD大鼠Kupffer細胞，提取并制備疏肝健脾方藥含藥血清，在LPS刺激大鼠Kupffer細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)基礎(chǔ)上，對Kupffer細胞進行疏肝健脾方藥含藥血清、p38MAPK抑制劑藥物干預(yù)，ELISA法檢測Kupffer細胞上清液中白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量的表達，Western印跡檢測Kupffer細胞 TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達。結(jié)果疏肝健脾方藥含藥血清提取量約為每只2～3 ml，大鼠獲得純化并經(jīng)免疫熒光法鑒定Kupffer細胞(0.5～1.0)×107個,Typan blue染色測定細胞活力均在95%以上；LPS組較空白血清組IL-6、TNF-α水平均有顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，各藥物干預(yù)組IL-6、TNF-α表達水平顯著降低(P<0.01)；與空白血清組比較，LPS組的p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表達均有顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，SB239063能顯著下調(diào)p38MAPK的蛋白表達水平(P<0.01)，肝健脾組亦有下調(diào)，但無顯著差異(P>0.05)；疏肝健脾組、SB239063組的p-p38MAPK蛋白表達水平均下調(diào)顯著(P<0.01)；TLR4蛋白表達水平以疏肝健脾組下調(diào)具有顯著性差異(P<0.01)，SB239063組下調(diào)無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論疏肝健脾方藥可能對LPS刺激大鼠Kupffer細胞炎癥損傷發(fā)揮保護作用,而含藥血清可能是其重要作用途徑之一。

關(guān)鍵詞〔〕疏肝健脾方藥；p38MAPK；Kupffer細胞；炎癥損傷

中圖分類號〔〕R28〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)

通訊作者：楊欽河(1961-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病研究。

1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院

第一作者：韓莉(1963-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病基礎(chǔ)與臨床研究。

Based on p38MAPK pathway investigate the effects of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum on LPS-stimulated inflammatory injury in Kupffer cells of rats

HAN Li,LI Yuan-Yuan,YANG Qin-He,etal.

The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the protective mechanism of the soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum on the Kupffer cells (KCs) of the inflammatory injured rats based on p38 mitogen activated protein kinases (p38MAPK) pathway.MethodsThirty SD rats were randomly divided into normal control,soothing liver and invigoration spleen recipes treatment(SGJP) and KCs extraction groups.After isolation,cultivating and identifying KCs of SD rats,at the same time,soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum was made up.KCs of rats with inflammation under LPS stimulation were interfered by normal serum,soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum and p38MAPK inhibitor drug (SB239063) respectively.The expressions of interleukin(IL)-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) levels on KCs supernatant were tested by ELISA,while the expressions of KCs toll-like receptor(TLR)4,p38MAPK and P-P38 mitogen-activated protein kinase (p-p38MAPK) were detected by Western blot.ResultsThe extracting volume of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum of each rats was about 2～3 ml (per rats).Purifying and identifying KCs through immunofluorescence assay,(0.5～1.0)×107 units of KCs were ascertained.Both IL-6 and TNF-α levels in LPS group were significantly elevated more than those of normal serum group(P<0.01).Compared with those of LPS group,IL-6 and TNF-α expression levels of the drug intervention group were significantly decreased (P<0.01).Compared with those of normal serum group,protein expressions of TLR4,p38MAPK,p-p38MAPK in LPS group were significantly increased (P<0.01).Compared with that of LPS group,TLR4 protein expression level in SGJP group had a significant difference (P<0.01).The p-p38MAPK protein expression level of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum and SB239063 groups were significantly down-regulated (P<0.01).ConclusionsSoothing liver and invigorating spleen recipes contained serum might have protective effects on the LPS-stimulated inflammatory injury in KCs of rats and contained serum might be one of important pathways of soothing liver and invigorating spleen recipes treating NASH.

【Key words】Soothing liver and invigorating spleen recipes；p38MAPK pathway；Kupffer cells；Inflammatory injury

研究表明，腸源性毒素通過血液循環(huán)進入肝臟后，能夠調(diào)控Kupffer細胞活性和細胞因子的產(chǎn)生；同時，腸道細菌定性和定量的變化導(dǎo)致腸道通透性增高和腸道內(nèi)毒素易位，也會解酒精個生月解方生肝炎誘導(dǎo)肝臟多種炎性細胞的轉(zhuǎn)錄基因及細胞因子的激活〔1，2〕。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜，是腸道細菌內(nèi)毒素最重要的組成部分，能夠誘導(dǎo)活化肝臟Kupffer細胞，通過調(diào)節(jié)某些炎癥通路，觸發(fā)細胞因子〔腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕的釋放，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)〔3,4〕。本課題組前期研究表明，中藥復(fù)方疏肝健脾方藥能夠作用于解酒精生脂肪生肝炎(NASH)大鼠肝細胞p38MAPK通路，抑制白介素(IL)-1、IL-6、TNF-α發(fā)揮抗炎作用，對解酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝臟p38MAPK蛋白表達也有明顯抑制作用〔5，6〕。本研究在建立LPS刺激下大鼠Kupffer 細胞炎癥損傷細胞模型基礎(chǔ)上，觀察疏肝健脾方藥含藥血清通過p38MAPK信號通路對LPS刺激下大鼠Kupffer 細胞炎癥損傷體外模型的保護作用。

1材料與方法

1.1藥物疏肝健脾方藥為柴胡疏肝散和參苓白術(shù)散的合方，柴胡疏肝散：柴胡6 g，白芍5 g，枳殼5 g，川芎5 g，陳皮6 g，香附5 g，炙甘草3 g。參苓白術(shù)散：人參15 g，茯苓15 g，白術(shù)15 g，白扁豆12 g，蓮子9 g，山藥15 g，砂仁6 g，薏苡仁9 g，桔梗6 g，炙甘草9 g。以上藥物均為深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供的中藥配方顆粒劑，購自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。

1.2動物及分組SPF級SD大鼠30只，體重(200±20)g，雌雄各半，暨南大學(xué)動物實驗管理中心提供，動物許可證號：SYXK(粵)2012-0117。大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、疏肝健脾方藥組，Kupffer細胞提取組。3組，每組10只，正常組給予等體積生理鹽水，疏肝健脾方藥組根據(jù)李儀奎等〔7〕提出的制備含藥血清的給藥方法，給藥劑量=在體實驗的給藥劑量×反應(yīng)系統(tǒng)中被稀釋的倍數(shù)，在體實驗的給藥劑量根據(jù)本課題組前期的研究結(jié)果定為11.9 g/kg〔8〕。因在下一步的細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中將加入20%的血清，疏肝健脾含藥血清組劑量為59.5 g/kg。

1.3試劑與儀器Ⅳ型膠原酶(美國Gbico公司)；胎牛血清(德國Hyclone公司)；兔多克隆抗CK18、ED1、山羊抗兔IgG(H+L),FITC conjugated(鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司)；LPS、SB239063(美國Sigma公司)；IL-6、TNF-α雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；抗p38 MAPK、抗磷酸化(P)p38MAPK(美國CST公司)；抗TLR4(英國Abcam公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Scientific公司)；Mini-sub CELLgT電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.4含藥血清的制備SD大鼠均飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動物實驗管理中心SPF級實驗室，給藥前常規(guī)喂養(yǎng)7 d。第8天起開始灌胃給藥，每天2次，12 h一次，連續(xù)3 d。腹主動脈采血，分離血清，并進行熱滅活處理。最后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Kupffer細胞提取采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶消化后提取Kupffer細胞，具體方法參照本課題組論文〔9〕，分離后所獲Kupffer細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6LPS刺激肝細胞炎癥損傷及藥物干預(yù)用LPS(40 mg/L)刺激在體外培養(yǎng)的Kupffer細胞，并分別用p38MAPK信號通路阻斷劑SB239063(2 mg/L)、20%疏肝健脾含藥血清予以干預(yù)，用20%空白血清(空白血清組)作為對照。

1.7指標(biāo)檢測

1.7.1Kupffer細胞形態(tài)、狀態(tài)及鑒定Typan blue染色后進行細胞計數(shù)，觀察各組細胞狀態(tài)，通過免疫熒光對Kupffer細胞進行鑒定。

1.7.2ELISA法檢測Kupffer細胞上清液中IL-6、TNF-α含量當(dāng)大鼠Kupffer細胞在96孔細胞培養(yǎng)板上貼壁生長、狀態(tài)良好、每孔細胞數(shù)量不少于1×104個時，加入不含血清的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后再按各組藥物干預(yù)方案添加藥物至目標(biāo)濃度后，放回細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸取細胞上清，保存?zhèn)溆谩Ｓ肊LISA方法檢測Kupffer細胞上清液中TNF-α、IL-6 的質(zhì)量濃度，具體操作嚴(yán)格按照說明書進行。

1.7.3Western印跡法檢測大鼠Kupffer細胞p38MAPK相關(guān)通路蛋白表達水平取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mmol/L。按照(5～10)×106個Kupffer細胞加入1 ml RIPA裂解液,4℃，10 000～14 000 r/min離心5～10 min，吸盡上清，留下細胞沉淀備用。根據(jù)碧云天BCA蛋白濃度試劑盒說明書對蛋白含量進行測定。Kupffer細胞樣本進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、4℃過夜。洗滌后加入二抗，孵育，充分洗滌，然后進行化學(xué)發(fā)光。曝光、 顯影、 定影,最后對結(jié)果進行光密度掃描分析 。

2結(jié)果

2.1細胞數(shù)量每只大鼠可獲得純化后的肝Kupffer細胞數(shù)量為(0.5～1.0)×107個，細胞活力均在95%以上。

2.2細胞形態(tài)及免疫熒光鑒定剛提取出的Kupffer細胞呈圓點形狀,一般15 min左右開始貼壁，3 h后基本完全貼壁，細胞呈梭形，部分有偽足。ED1免疫熒光鑒定，可見梭形的Kupffer細胞呈綠色熒光，即Kupffer細胞呈ED1陽性表達。見圖1。

Kupffer細胞

Kupffer細胞免疫熒光鑒定

2.3Kupffer細胞狀態(tài)空白血清組Kupffer細胞貼壁生長，少見細胞脫落，細胞多有偽足，呈健康的梭形細胞形態(tài)。LPS組可見大量細胞脫落或細胞攣縮成小圓點，貼壁細胞極少，細胞核不可見，偽足基本全部消失。見圖2。

2.4ELISA法檢測Kupffer細胞上清液中IL-6、TNF-α含量與空白血清組比較，LPS組中IL-6、TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)。與LPS組比較，各藥物干預(yù)組IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.5Western印跡法檢測大鼠肝細胞p38MAPK相關(guān)通路蛋白表達水平與空白血清組比較，LPS組p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表達均顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與LPS組比較，SB239063組均能顯著下調(diào)上述蛋白表達水平(P<0.01)；疏肝健脾組亦能下調(diào)p38MAPK的蛋白表達水平，但無顯著差異(P>0.05)，疏肝健脾組、SB239063組p-p38MAPK的蛋白表達水平均下調(diào)顯著(P<0.01)，TLR4蛋白表達水平以疏肝健脾組下調(diào)最顯著(P<0.01)；SB239063組亦能下調(diào)TLR4蛋白表達水平，但無顯著差異(P>0.05)，見表2，圖2。

表1　大鼠Kupffer細胞IL-6、TNF-α表達

與空白血清組比較：1)P<0.05；與LPS組比較：2)P<0.01

表2　大鼠肝細胞p38MAPK信號通路相關(guān)

與空白血清組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與LPS組比較：3)P<0.01

圖2　Kupffer細胞p38MAPK、 p-p38MAPK、TLR4蛋白灰度值比較

3討論

Kupffer細胞被認為是腸-肝軸的第一道反應(yīng)程序，體內(nèi)研究表明，腸源性內(nèi)毒素LPS能夠通過刺激肝Kupffer細胞導(dǎo)致IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致肝組織損傷，加重NASH的發(fā)展演變〔10,11〕。本次體外研究表明LPS能夠刺激Kupffer細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6炎癥介質(zhì)，與體內(nèi)實驗結(jié)果相符。這種體內(nèi)外研究的一致性，為NASH發(fā)病機制體外研究提供了基礎(chǔ)。

LPS刺激Kupffer細胞導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放增加，在單純脂肪性肝病變向NASH的發(fā)展演變發(fā)揮了重要作用。TLR4是p38MAPK的上游通路，LPS是TLR4的最重要的配體，由LPS與TLR4相結(jié)合，通過系列級聯(lián)反應(yīng)，啟動TLR4介導(dǎo)的信號通路。在通過MYD88依賴反應(yīng)通路，激活TRAF-6，并與接頭蛋白TAB-1相結(jié)合，再激活TAK-1。TAK-1是TLRS通路和MAPKS的連接紐帶。因此，TLR4最終激活p38MAPK的活化，同時p38MAPK的活化又與IL-6、TNF-α、IL-10等炎癥因子的表達密切相關(guān)〔12～14〕。本研究表明，LPS組中LPS刺激Kupffer細胞TLR蛋白表達明顯增加，激活導(dǎo)致p38MAPK蛋白表達及磷酸化。提示p38MAPK信號通路可能是LPS刺激Kupffer細胞IL-6、TNF-α炎癥介質(zhì)表達明顯增加重要通路。

疏肝健脾方是古代名方柴胡疏肝散和參苓白術(shù)散組合方而成，二者主要活性成分包括阿魏酸、人參皂苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、新橙皮苷、芍藥內(nèi)酯苷和白術(shù)苷等。其中柚皮苷、橙皮苷和阿魏酸等活性成分被證實具有一定的抗炎作用。前期體內(nèi)實驗研究表明，疏肝健脾方藥具有通過調(diào)控Kupffer細胞，使p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達及活化，減少炎癥介質(zhì)(IL-6、TNF-α)的釋放，最終達到減輕炎癥損傷的效果〔5，6〕。將含藥血清用于體外細胞培養(yǎng)是中藥復(fù)方研究的重要方向，藥物將受試藥物經(jīng)口給予動物后，取其血清作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中研究其藥理作用，比較接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實過程，其原有成分或在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性成分，或代謝后失活，或沒有被吸收入體內(nèi)，或通過第二信使而間接起作用都可以通過血清藥理學(xué)反映出來，理論上更具備科學(xué)性、真實性〔15〕。本次研究應(yīng)用從SD大鼠中提取并制備的疏肝健脾方藥含藥血清，并將含藥血清對LPS刺激大鼠體外Kupffer細胞造成的炎癥損傷進行干預(yù)結(jié)果提示含藥血清調(diào)控Kupffer細胞p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達及活化，減少炎癥介質(zhì)(IL-6、TNF-α)的釋放，這與體內(nèi)試驗的研究結(jié)果具有一致性。藥物吸收入血可能是疏肝健脾方藥作用于Kupffer細胞p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達及活化，減少炎癥介質(zhì)(IL-6、TNF-α)的釋放，最終達到減輕炎癥損傷的重要作用途徑。有研究表明〔16,17〕參苓白術(shù)散及柴胡疏肝散具有調(diào)節(jié)腸道菌群失衡及殺菌抗炎的效果，而LPS作為是細菌內(nèi)毒素最重要的組成部分，在NASH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。疏肝健脾方藥是否能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境而減少內(nèi)毒素LPS產(chǎn)生有待進一步研究。

4參考文獻

1Nagata K,Suzuki H,Sakaguchi S.Common pathogenic mechanism in development progression of liver injury caused by non-alcoholic or alcoholic steatohepatitis〔J〕.J Toxicol Sci,2007;32(5):453-68.

2Vajro P,Paolella G,Poeta M,etal.Pediatric non alcoholic fatty liver disease:more on novel treatment targets〔J〕.BMC Pediatrics,2013;13(1):109.

3Shanab AA,Scully P,Crosbie O,etal.Small intestinal bacterial overgrowth in nonalcoholic steatohepatitis:association with toll-like receptor 4 expression and plasma levels of interleukin 8〔J〕.Digest Dis Sci,2011;56(5):1524-34.

4Bilzer M,Roggel F,Gerbes AL.Role of kupffer cells in host defense and liver disease〔J〕.Liver Int,2006;26(10):1175-86.

5Yang QH,Xu YJ,Feng GF,etal.p38 Mapk signal pathway involved in anti-inflammatory effect of chaihu-shugan-san and shen-ling-bai-zhu-san on hepatocyte in non-alcoholic steatohepatitis rats〔J〕.Afr J Tradit Complem,2013;11(1):213-21.

6楊欽河,謝芳,王鳳珍,等.不同治法方藥對脂肪肝大鼠肝組織 NF-κBp65 及〔J〕.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009;27(2):141.

7李儀奎.中藥血清藥理學(xué)實驗方法的若干問題〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,1999;(2):31-4.

8韓莉,楊欽河,楊雪松,等.疏肝健脾方藥對 NASH 大鼠 Kupffer 細胞 NF-κB p65 和 IKKβ mRNA 及蛋白表達的影響〔J〕.中國病理生理雜志,2013;29(4):641-6.

9馮高飛,楊欽河,王文晶,等.非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝細胞和庫普弗細胞同時分離及鑒定〔J〕.廣東醫(yī)學(xué),2012;33(1):40-3.

10Kudo H,Takahara T,Yata Y,etal.Lipopolysaccharide triggered TNF-α-induced hepatocyte apoptosis in a murine non-alcoholic steatohepatitis model〔J〕.J Hepatol,2009;51(1):168-75.

11G?bele E,Dostert K,Hofmann C,etal.DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in Experimental NASH〔J〕.J Hepatol,2011;55(6):1391-9.

12Yang L,Seki E.Toll-like receptors in liver fibrosis:cellular crosstalk and mechanisms〔J〕.Front Physiol,2012;3(1):1-18.

13Agrawal S,Gollapudi S,Su H,etal.Leptin activates human B cells to secrete TNF-α,IL-6,and IL-10 via JAK2/STAT3 and p38MAPK/ERK1/2 signaling pathway〔J〕.J Clin Immunol，2011;31(3):472-8.

14Park EJ,Lee JH,Yu GY,etal.Dietary and genetic obesity promote liver inflammation and tumorigenesis by enhancing IL-6 and TNF expression〔J〕.Cell,2010;140(2):197-208.

15楊萃.中藥復(fù)方在體外實驗的研究進展〔J〕.光明中醫(yī),2013;28(10):2229-31.

16舒青龍,徐剛,葉荷平,等.參苓白術(shù)散對體外艱難梭菌生長的影響〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志,2013;19(2):258-62.

17彭穎,李曉波,彭穎.脾虛證與腸道微生態(tài)〔J〕.世界華人消化雜志,2012;20(34):3287-91.

〔2014-05-17修回〕

(編輯李相軍)