姚 春，李澤生，李薇莎，耿秀英，白燕冰，周侯光

(云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南瑞麗 678600)

串珠石斛組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究

姚 春，李澤生*，李薇莎，耿秀英，白燕冰，周侯光

(云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，云南瑞麗 678600)

摘要[目的]對串珠石斛的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)進(jìn)行研究。[方法]以串珠石斛成熟果實(shí)中的種子為外植體，通過無菌萌發(fā)、增殖分化、生根壯苗、煉苗移栽4個(gè)階段，建立了串珠石斛的組織培養(yǎng)與快速繁殖體系。[結(jié)果]串珠石斛最適種子萌發(fā)培養(yǎng)基為3/4MS +洋芋汁20 g/L，萌發(fā)率達(dá)98%以上；增殖分化培養(yǎng)基為3/4MS + 洋芋汁60 g/L + 香蕉汁50 g/L，增殖效果好，分化良好；生根壯苗培養(yǎng)基為3/4MS + 洋芋汁50 g/L + 香蕉汁80 g/L + 活性炭0.4 g/L，根系發(fā)達(dá)，植株健壯；煉苗后，移栽在松樹皮基質(zhì)上，成活率達(dá)90%以上。[結(jié)論]該研究為串珠石斛種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞串珠石斛；組織培養(yǎng)；快速繁殖

串珠石斛(Dendrobium falconeriHook.)為蘭科石斛屬多年生草本植物，附生于海拔800～1 900m的山谷巖石和山地密林中樹干上，主要分布在我國湖南東南部(資興)、臺(tái)灣(苗栗至嘉義一帶)、廣西東北部(臨桂、靈川)、云南東南部至西部(石屏、綠春、景洪、騰沖、龍陵、盈江、鎮(zhèn)康)，不丹、印度東北部、緬甸、泰國也有分布。串珠石斛為我國傳統(tǒng)藥用石斛[1]，其莖可入藥，用于治發(fā)燒[2]。其花朵繽紛多彩，莖稈像成串的珠子墜在絲線上，具有很高的觀賞價(jià)值，鮮小林等[3]運(yùn)用層次分析法(AHP)[4]得出串珠石斛觀賞利用價(jià)值綜合評分為3.049，有很大的開發(fā)利用價(jià)值。但串珠石斛種子極小，無胚乳，自然條件下很難萌發(fā)，分株、扦插等方式繁殖率低，遠(yuǎn)不能滿足市場需求，加之人工采伐、生長環(huán)境遭到破壞，串珠石斛資源受到了威脅，數(shù)量不斷減少。

目前，國內(nèi)外對鉤狀石斛、鐵皮石斛、流蘇石斛等組織培養(yǎng)技術(shù)已有相關(guān)報(bào)道[5-7]，但至今尚未見串珠石斛組織培養(yǎng)方面的研究。筆者以串珠石斛種子為外植體，建立其組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)體系，培育大量優(yōu)質(zhì)串珠石斛種苗，為石斛種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料串珠石斛(Dendrobium falconeriHook.)種子來源于云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所石斛種質(zhì)資源圃1號(hào)棚串珠石斛植株上成熟未開裂的健康蒴果。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。萌發(fā)培養(yǎng)基：3/4MS+ 洋芋汁0～20.0g/L；增殖分化培養(yǎng)基：3/4MS+洋芋汁0～80g/L+ 香蕉汁0～80g/L+ 活性炭0.4～0.6g/L+NAA0～0.1mg/L+ 6-BA0.2～0.4mg/L；生根壯苗培養(yǎng)基：3/4MS+洋芋汁30～80g/L+ 香蕉汁30～80g/L+ 活性炭0.4g/L。以上培養(yǎng)基均加入25g/L蔗糖和4.8g/L瓊脂粉，pH5.8～6.0。培養(yǎng)溫度23～27 ℃，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度1 500～3 000lx。

1.2.2外植體處理。將串珠石斛蒴果放入適量濃度的洗潔精水溶液中，用軟毛刷輕刷表面，流動(dòng)自來水沖洗30min。在超凈工作臺(tái)上用無菌水清洗2次，75%乙醇消毒30s，2%次氯酸鈉溶液滅菌10～15min，無菌水漂洗4次。濾紙吸干表面水分，將其對半切開。

1.2.3無菌萌發(fā)。將消毒好的種子均勻播入萌發(fā)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理播種30瓶，先暗培養(yǎng)7d，再進(jìn)行光照培養(yǎng)。觀察記錄種子萌發(fā)、污染情況。

1.2.4增殖分化。將萌發(fā)最好的原球莖均勻轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基中，共14個(gè)處理，每個(gè)處理30瓶。60d后統(tǒng)計(jì)增殖分化情況。

1.2.5生根壯苗。選取生長良好、高3cm的幼苗接入生根壯苗培養(yǎng)基中，共3個(gè)處理，每個(gè)處理30瓶，每瓶接種7叢，每叢2株。觀察根、莖、葉生長情況，70d后測量數(shù)據(jù)，每個(gè)處理隨機(jī)抽取10瓶，每瓶隨機(jī)選取10株。

1.2.6煉苗和移栽。 當(dāng)瓶內(nèi)80%以上的苗高5～8cm，有5～8條3cm以上的粗壯根時(shí)將瓶苗從培養(yǎng)室內(nèi)移至遮光率為70%～85%的溫室大棚內(nèi)，放置20d，之后再打開瓶蓋繼續(xù)放置3d，棚內(nèi)要保持通風(fēng)透氣，控制好光照，使瓶苗逐漸接受自然光，適應(yīng)自然環(huán)境。

移栽時(shí)將苗從瓶內(nèi)取出，用自來水將附著在根上的培養(yǎng)基清洗干凈，然后放進(jìn)稀釋2 000倍的多菌靈、百菌清等殺菌劑溶液中消毒3～5min，撈起放在透氣塑料筐上晾干水分，按3株/叢，株行距5cm×5cm移栽到鋪有松樹皮基質(zhì)的苗床上，栽后注意保持環(huán)境通風(fēng)、遮陽，苗床上無積水，濕度保持在75%～85%，待苗抽出新芽、新葉、新根后即可移栽大田。

2結(jié)果與分析

2.1種子無菌萌發(fā)情況由表1可知，3/4MS+洋芋汁20g/L處理種子培養(yǎng)15d后開始慢慢轉(zhuǎn)綠，25d后種胚開始膨大，逐漸形成綠色的原球莖，之后原球莖不斷增加，重疊堆積在培養(yǎng)基上。由此可知，添加一定濃度的洋芋汁可加快種子萌發(fā)?？梢?，培養(yǎng)基3/4MS+洋芋汁20g/L適合串珠種子無菌萌發(fā)。

表1　不同處理種子萌發(fā)情況

注：“+++”表示萌發(fā)情況良好，“++++”表示萌發(fā)情況最優(yōu)。

2.2增殖分化情況原球莖轉(zhuǎn)入增殖分化培養(yǎng)基后，發(fā)育速度加快，20d后有原球莖開始長出小芽，小芽不斷增殖分化，60d后長成大量綠色的無菌幼苗。串珠石斛增殖分化情況在不同處理培養(yǎng)基上表現(xiàn)不一(表2)：①在不添加任何激素、洋芋汁、香蕉汁的空白3/4MS、1/2MS培養(yǎng)基上均不能生長，15d后小芽開始變黃，30d后慢慢枯死；②在添加不同比例洋芋汁和香蕉汁的培養(yǎng)基上均能生長，其中在培養(yǎng)基3/4MS+洋芋汁60g/L+香蕉汁50g/L上生長的苗增殖分化效果較好，苗較整齊，生長快速；③在只添加洋芋汁的培養(yǎng)基上增殖良好，但苗長勢弱；只添加香蕉汁的培養(yǎng)基增殖效果不明顯，但苗較健壯，且根系發(fā)達(dá)；④在加有一定激素的培養(yǎng)基上長勢不太突出，與加一定比列洋芋汁和香蕉汁的效果類似?？梢?，最佳增殖分化培養(yǎng)基為3/4MS+ 洋芋汁60g/L+ 香蕉汁50g/L。

2.3生根壯苗情況串珠石斛在加有一定洋芋汁和香蕉汁的培養(yǎng)基上均能長根，但長勢因比例不同而有所差異：洋芋汁比例高于香蕉汁的培養(yǎng)基上增殖效果明顯，但易增生小苗，植株生長慢，長勢較弱，根短??；香蕉汁比例高于洋芋汁的培養(yǎng)基植株長勢較好，根系發(fā)達(dá)。適當(dāng)增加香蕉汁濃度有利于生根壯苗，由表3可知，串珠石斛最適生根壯苗培養(yǎng)基為3/4MS+ 洋芋汁50g/L+香蕉汁80g/L+活性炭0.4g/L。

表2　不同培養(yǎng)基對串珠石斛增殖分化的影響

注：“×”表示死亡，“+”、“++”、“+++”、“++++”分別表示長勢差、一般、良好、優(yōu)。

表3　串珠石斛瓶苗生長情況

2.4煉苗移栽煉苗20d后，植株葉片顏色加深，根系更加發(fā)達(dá)。移栽50d后開始有新芽、新根長出，根系更加健壯，植株成活率達(dá)90%以上。

3結(jié)論與討論

該研究利用串珠石斛種子，通過無菌萌發(fā)、增殖分化、生根壯苗、煉苗移栽4個(gè)階段，建立了串珠石斛組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)體系，解決了串珠石斛自然繁殖率低、市場種源短缺的難題，為串珠石斛種質(zhì)資源的保護(hù)與開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基對種苗的生長有明顯影響，在不加任何添加物的3/4MS培養(yǎng)基上，種子能夠萌發(fā)，且萌發(fā)

情況良好，但幼苗在其培養(yǎng)基上不能生長，轉(zhuǎn)入15d后開始變黃，30d后逐漸死亡，原因是MS培養(yǎng)基所含的成分不能滿足串珠石斛生長需要，需要在其基礎(chǔ)上添加一定的植物激素或有機(jī)添加物才能使幼苗正常生長。在培養(yǎng)基上添加一定的洋芋汁能明顯促進(jìn)苗的增殖，添加一定的香蕉汁能促進(jìn)生根，在繼代培養(yǎng)中，以兩者配合效果更佳。適量的活性炭對壯苗也起一定的作用。植物激素可以促進(jìn)種苗的生長，但易引起變異，且苗整齊度差。該研究表明，在不添加任何植物激素的前提下，調(diào)節(jié)有機(jī)添加物的比例，同樣可以快速培育出大量優(yōu)質(zhì)種苗。在該研究中筆者減少了繼代次數(shù)，采用天然有機(jī)添加物替代植物激素，既降低了種苗的生產(chǎn)成本，又進(jìn)一步保障了種苗的安全性。

參考文獻(xiàn)

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中圖分類號(hào)S503.53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)30-033-02

基金項(xiàng)目農(nóng)業(yè)部農(nóng)墾局項(xiàng)目“石斛種質(zhì)資源保護(hù)”(15RZZY-21)。

作者簡介姚春(1988- )，女，云南石屏人，研究實(shí)習(xí)員，從事藥用植物研究。*通訊作者。

收稿日期2015-09-15

ResearchontheTissueCultureandRapidPropagationTechnologyofDendrobium falconeriHook

YAOChun,LIZe-sheng*, LI Wei-sha et al(DehongInstituteofTropicalAgriculture,Ruili,Yunnan678600)

Abstract[Objective] The tissue culture and rapid propagation technology of Dendrobium falconeri Hook was researched in this paper. [Method] Tissue culture and rapid propagation techniques for Dendrobium falconeri Hook were researched through aseptic germination, proliferation and differentiation of protocorm-like bodies, strengthening and rooting, transplanting, with the seeds from mature fruit of Dendrobium falconeri Hook as explants. [Result] The suitable medium for seeds germination was 3/4MS + potato juice 20 g/L, the germination rate of which reached 98%. The best proliferation medium was 3/4MS + potato juice 60 g/L + banana juice 50 g/L, the proliferation effect which was well. The strengthening and rooting medium was 3/4MS + potato juice 50 g/L + banana juice 80 g/L + carbon 0.4 g/L,the root system which was developed. The plantlets with acclimatization were transferred to the matrix of pine bark and the transplanting survival rate was up to 90%. [Conclusion] The research can provide the scientific basis for protecting germplasm resources and the development and use of Dendrobium falconeri Hook.

Key wordsDendrobium falconeri Hook.; Tissue culture; Rapid propagation