陳 崇，周桃玉，溫旺榮

（暨南大學附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗中心，廣東廣州510630）

家族性和三陰性乳腺癌血清中miR-21的表達

陳 崇，周桃玉，溫旺榮

（暨南大學附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗中心，廣東廣州510630）

目的：檢測血清miR-21在乳腺癌中的表達差異，為進一步闡明miR-21在家族性和三陰性乳腺癌發(fā)病機制中的作用．方法：收集健康女性體檢者、具有患乳腺癌高風險者、不同種類乳腺癌患者的血清．以線蟲miR-39為外參，通過實時熒光定量PCR檢測77份血清中miR-21的表達水平．結(jié)果：家族性乳腺癌組、三陰性乳腺癌組和乳腺癌高風險組血清miR-21水平顯著高于正常對照組、其他乳腺癌組（P＜0．01）．血清miR-21的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67高表達有關(guān)（P＜0．01）．結(jié)果顯示血清miR-21表達量在家族性和三陰性乳腺癌中升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki67表達有關(guān)．結(jié)論：血清miR-21與三陰性、家族性乳腺癌的發(fā)生有緊密聯(lián)系，其表達增高與乳腺癌的遺傳性、惡性程度及預后判斷有關(guān)．

miR-21；家族性乳腺癌；三陰性乳腺癌；血清；熒光定量PCR

乳腺癌的發(fā)病率位居全球女性惡性腫瘤首位．中國乳腺癌的發(fā)病率以每年3%～4%的速度增長，現(xiàn)在已成為女性癌癥死亡的主要原因．乳腺癌是一種具有明顯遺傳特征的惡性疾病，是環(huán)境、遺傳等因素共同作用的結(jié)果［1］．中國家族性乳腺癌占所有乳腺癌的20%～25%．而三陰性乳腺癌（雌激素、孕激素受體與人表皮生長因子受體-2均為陰性者）占所有乳腺癌的約15%～20%，且擁有比其他類型的乳腺癌更高的復發(fā)率和更差的預后．近年來，越來越多的研究證據(jù)表明microRNA可以作為檢測癌癥存在和判斷預后的生物標志物．其中miR-21在癌癥患者中的表達量的改變最為常見［2］．2005年Iorio等［3］首次發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌組織的表達量明顯高于正常乳腺組織，Wang F等［4］發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌患者組織和血清中表達均有增高．因此，本研究選擇乳腺癌高危者和不同類型的乳腺癌，特別是家族性和三陰性乳腺癌患者血清中miR-21表達水平進行檢測，并分析其在家族性和三陰性乳腺癌中的發(fā)病作用．

1 材料和方法

1．1 研究對象

研究對象來自暨南大學附屬第一醫(yī)院2013年1月至2014年5月門診、住院就診者．分為以下4組：A組為三陰性乳腺癌病人，共20例，平均年齡（53±1．33）歲；B組為家族性乳腺癌病人，共8例（已剔除三陰性的病例），平均年齡（49±1．98）歲；B2組為家族性乳腺癌病人的健康一級親屬（具有患乳腺癌高風險），共9例，平均年齡（37±4．12）歲；C組為其他乳腺癌病人（除三陰性及家族性乳腺癌），共20例，平均年齡（56±2．43）歲；D組為對照組，收集同期體檢者血清（入選標準是無腫瘤病史和臨床體征的健康女性），共20例，平均年齡（45±3．24）歲．收集血清后放置－80℃冰箱保存．

1．2 所用儀器和器材

Light Cycler1．5 Instrument羅氏實時熒光定量儀（德國Roche）；ABI Prism 7000熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；高速冷凍離心機（中國科技大學中佳公司）；Ⅱ級B2型生物安全柜（新加坡ESCO）；Biophotomet加樣槍（德國Eppendorf）；Biophotometer生物分光光度計（德國Eppendorf）．

1．3 主要試劑

Trizol試劑（美國Invitrogen）；異丙醇、氯仿、無水乙醇（廣州達暉公司）；HmiR-21 Hairpin-itTMReal-Time PCR Kit和Cel-miR-39 Hairpin-itTMReal-Time PCR Kit（上海吉瑪公司）；線蟲Cel-miR-39的雙鏈mimics（上海吉瑪公司）；RNA酶抑制劑（加拿大Thermo Fermentas）．

1．4 方法

（1）樣本準備 用含促凝膠的真空采血管抽取研究對象4 mL外周靜脈血，待血液凝固后3 000 r／min離心10 min，取上層血清至1．5 mL EP管放－80℃冰箱保存．

（2）總RNA提取 血清樣本置冰上融化后，吸取250 μL加入1 mL Trizol中混勻，室溫放置5 min后，加入mimics 4 μL．加入200 μL氯仿，在漩渦混合器中劇烈振蕩15 s，置入離心機中4℃12 000 r／min離心15 min．將上層液相（約600 μL）吸出，加入500 μL異丙醇中顛倒混勻，室溫靜置10 min．4℃12 000 r／min離心10 min后，棄去上清液．用1 mL配好預冷的體積分數(shù)為75%乙醇（750 μL無水乙醇加250 μL DEPC處理水）反復洗滌RNA沉淀．4℃7 500 r／min離心5 min，棄去上清．開蓋室溫干燥RNA沉淀25 min．加入30 μL DEPC處理水反復多次吹打混勻RNA沉淀，使其溶解．測定總RNA濃度，得到的總RNA純度范圍在1．8～2．0，濃度為25～50 ng／L．

（3）逆轉(zhuǎn)錄反應 反應體系總體積為20 μL，包括5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol／L）0．75 μL，miR-21逆轉(zhuǎn)錄引物（1 μmol／L）1．2 μL，RNA酶抑制劑（40 U／μL）0．25 μL，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U／μL）0．2 μL，總RNA樣本5 μL，DEPC處理水8．6 μL．反應設(shè)1個復孔．反應條件為25℃30 min，42℃30 min，85℃5 min．外參Cel-miR-39逆轉(zhuǎn)錄反應體系同上．陰性對照以生理鹽水代替提取的總RNA產(chǎn)物．

（4）實時熒光定量PCR 反應體系總體積為20 μL，包括2×Master Mix 10 μL（包含MgCl2，dNTPs、SYBR Green熒光染料）10 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物套裝（5 mol／μL）0．32 μL，Taq DNA聚合酶（5×106U／L）0．2 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，DEPC處理水8．6 μL．反應設(shè)1個復孔．反應條件為95℃預變性3 min，95℃12 s、62℃40 s，40個循環(huán)．外參Cel-miR-39反應體系同上．設(shè)置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴增和引物二聚體的出現(xiàn)．空白對照以生理鹽水代替逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物．

（5）血清中miR-21表達量 PCR擴增結(jié)果用Ct值來表示，Ct值的含義是PCR反應中熒光信號達到所設(shè)定的閾值時的循環(huán)數(shù)．目的基因的相對表達量（relative expression，RQ）用2－ΔΔCt表示［5］．ΔΔCt＝（標本CtmiR－21－標本CtCel－miR－39）－（對照CtmiR－21－對照CtCel－miR－39），健康體檢者標本血清的miR－21作為對照．

1．5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件處理，相對表達量2－ΔΔCt成偏態(tài)分布且方差不齊，將2－ΔΔCt進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，經(jīng)單樣本K－S檢驗，符合正態(tài)分布（Z＝0．643，P＝0．803＞0．05），經(jīng)Levene檢驗結(jié)果方差不齊（P＝0．007＜0．05）．采用單因素ANOVA分析多個樣本均數(shù)間比較，兩兩樣本間采用Tamhane's T2法檢驗．在不同的乳腺癌臨床病理參數(shù)組之間的血清miR-21表達水平比較，用Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0．05為有統(tǒng)計學差異．

2 結(jié)果

2．1 miR-21和Cel-miR-39的熔解曲線

miR-21熔解曲線在79℃左右呈現(xiàn)單峰；CelmiR-39熔解曲線在81℃左右呈現(xiàn)單峰，且均無引物二聚體與雜峰存在，表明PCR反應參數(shù)合適，擴增目標產(chǎn)物特異性較好（圖1）．

A：miR-21；B：miR-39；C：miR-21陰性質(zhì)控；D：miR-39陰性質(zhì)控．圖1 miR-21和Cel-miR-39的熔解曲線A：miR-21；B：miR-39；C：miR-21 negative control；D：miR-39 negative control．Fig．1 Melting curves for miR-21 and miR-39

2．2 各組血清miR-21的表達差異

（1）實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 各組研究對象血清miR-21及Cel-miR-39的呈標準S型反應曲線，陰性對照曲線呈不規(guī)則型，空白對照無擴增曲線（圖2、圖3）．

A：三陰性乳腺癌；B：家族性乳腺癌；B2：乳腺癌高危者；C：其他乳腺癌；D：正常對照；N：陰性對照；K：空白對照．圖2 各組血清中miR-21實時熒光定量PCR擴增曲線A：triple negative breast cancer；B：familial breast cancer；B2：high risk for breast cancer C：other breast cancer；D：healthy control；N：negative control；K：blank control．Fig．2 The amplification curves of fluorescence quantitative PCR for serum miR-21 in different groups

A：三陰性乳腺癌；B：家族性乳腺癌；B2：乳腺癌高危者；C：其他乳腺癌；D：正常對照；N：陰性對照K：空白對照．圖3 各組血清中Cel-miR-39的實時熒光定量PCR擴增曲線A：triple negative breast cancer；B：familial breast cancer；B2：high risk for breast cancer C：other breast cancer；D：healthy control；N：negative control；K：blank control．Fig．3 The amplification curves of fluorescence quantitative PCR for exogenous internal reference miR-39 in different groups

（2）正常對照、乳腺癌A、B、B2、C組的血清miR-21表達水平比較 以ΔCt表示標本miR-21的表達量．當ΔCt值越低，說明miR-21在研究對象體內(nèi)表達量越高，檢測結(jié)果顯示了血清miR-21的表達量．所有研究對象血清樣本中的miR-21、miR-39檢測結(jié)果見表1．

表1 血清miR-21在正常對照與不同乳腺癌分組中表達差異1）Table 1 Differential expression of serum miR-21 in healthy control group and various of breast cancer groups（±s）

表1 血清miR-21在正常對照與不同乳腺癌分組中表達差異1）Table 1 Differential expression of serum miR-21 in healthy control group and various of breast cancer groups（±s）

1）數(shù)據(jù)不成正態(tài)分布采用M（P25，P75）表示．

組別nmiR-21 CtCel-mir-39 Ct2－ΔΔCt1）log102－ΔΔCtA組2025．39±1．5912．11±0．874．00（2．32，11．71）0．67±0．57 B組823．86±1．8411．77±0．9412．87（2．63，56．59）1．06±0．74B2組925．13±0．8011．76±0．654．26（2．97，5．98）0．64±0．19 C組2026．45±1．5911．02±0．800．58（0．38，1．14）－0．16±0．30 D組2027．97±0．7612．46±1．010．76（0．54，1．79）0．00±0．40

經(jīng)單因素ANOVA方差分析，比較5組間的相對表達量有統(tǒng)計學差異（F＝17．11，P＝0．00＜0．01），進一步使用Tamhane's T2法檢驗做各個分組間的比較，三陰性乳腺癌組、家族性乳腺癌組血清miR-21水平顯著高于正常對照組和其他乳腺癌組（P＜0．01）；乳腺癌高危組血清miR-21水平顯著高于正常對照組和其他乳腺癌組（P＜0．01）；三陰性乳腺癌組、家族性乳腺癌組和乳腺癌高危組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；正常對照組與其他乳腺癌組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（圖4）．

2．3 血清miR-21的表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

乳腺癌血清中miR-21相對表達量與腫瘤單側(cè)或雙側(cè)發(fā)生（P＝0．679）、年齡（P＝0．245）、CA153（P＝0．893）、月經(jīng)狀況（P＝0．717）無明顯關(guān)系，各分組間差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0．05）．乳腺癌血清中miR-21相對表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0．000）、Ki67（P＝0．006）呈正相關(guān)（表2），P＜0．05有統(tǒng)計學意義（圖5、6）．

A：三陰性乳腺癌；B：家族性乳腺癌；B2：乳腺癌高危者；C：其他乳腺癌；D：正常對照．圖4 各組血清中miR-21表達量（n＝77）比較A：triple negative breast cancer；B：familial breast cancer；B2：high risk for breast cancer C：other breast cancer；D：healthy control．Fig．4 The serum miR-21 expression levels in different groups

表2 血清miR-21表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系Table 2 Assocation of miR-21 expression with clinical and pathological features

圖5 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與血清miR-21表達統(tǒng)計圖Fig．5 Assocation of miR-21 expression with lymph nod metastasis

圖6 Ki67與血清miR-21表達統(tǒng)計圖Fig．6 Assocation of miR-21 expression with ki67

3 討論

微小RNA（miRNA）是內(nèi)源性非編碼的小型核糖核酸，廣泛存在于動物、植物和病毒中，能夠與特定的目標mRNA中序列互補配對，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達或翻譯，參與生物體的生理、病理過程．研究表明循環(huán)中miRNA與腫瘤的臨床病理特征密切相關(guān)，其表達情況可以用于惡性腫瘤的診斷、預后判斷和治療．

通過實時熒光定量PCR檢測人體血清中miRNA的表達量，消除在RNA提取過程中樣品間的差異十分關(guān)鍵，之前大多數(shù)研究都選擇內(nèi)參如U6來達到這一作用，但是內(nèi)參在人體疾病狀態(tài)下是否影響表達量也暫不可知，并且在血清中來源與表達目前為止仍然存在許多不清楚的因素．本實驗引入人工合成的線蟲miR-39作為外源性的內(nèi)參，由于人體血清中不含有此序列且影響因素少，并且這一做法已得到驗證［6］．

已有研究證明，miR-21編碼基因位于17q23．2［7］．在結(jié)腸癌［8］、肺癌［9］、胃癌［10］、乳腺癌［11］等多種腫瘤中表達異常．miR-21在乳腺癌組織高于正常乳腺組織中的表達水平，其表達水平與一些臨床和病理特征相關(guān)［12－14］．而且國內(nèi)外學者已研究關(guān)注人體血液循環(huán)中miR-21，并認為血清中miR-21表達升高對惡性腫瘤的早期診斷［2］、早期治療［15］、腫瘤轉(zhuǎn)移［11］、腫瘤惡化［16］和預后［2］等方面具有預測價值．因此，本組對乳腺癌患者血清miR-21進行臨床研究．

本研究主要對正常人、乳腺癌高風險人群、乳腺癌患者血清miR-21的表達水平進行檢測，并分析比較之間差異．檢測結(jié)果表明，家族性乳腺癌組的血清miR-21表達水平在所有分組中最高；且家族性乳腺癌組、三陰性乳腺癌組和乳腺癌高危組血清miR-21的表達量均高于其他乳腺癌組和正常對照組（P＜0．05）．王責年等的研究也顯示［17］血清miR-21在乳腺癌患者血清呈高表達；Wang B等［13］使用SYBR green實時熒光定量PCR檢測正常對照和乳腺癌病人血清中miR-21的表達量，發(fā)現(xiàn)miR-21在癌癥患者血清中顯著增高（P＜0．001）．上述兩個研究結(jié)論與本文結(jié)果一致，但存在一定差異，差異在于上述兩個研究中家族性乳腺癌和三陰性乳腺癌都歸入乳腺癌組，但本研究將家族性乳腺癌和三陰性乳腺癌患者區(qū)分出來研究分析，所以本文的結(jié)論為正常對照組與其他乳腺癌組的差異不存在統(tǒng)計學意義，而家族性乳腺癌和三陰性乳腺癌組均升高．正如Radojicic J［18］等研究中，miR-21在原發(fā)性三陰性乳腺癌患者中高表達，與本研究相一致．

本研究還發(fā)現(xiàn)9例家族性乳腺癌患者的一級健康親屬血清中miR-21表達量增高，與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）．miR-21在乳腺癌高危者血清中高表達結(jié)合乳腺癌家族史可望用于預測患乳腺癌高風險，當然這一結(jié)論還需增加樣本量進一步的實驗驗證．

48例乳腺癌組患者血清miR-21的檢測結(jié)果與乳腺癌臨床病理參數(shù)結(jié)果顯示，血清miR-21的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0．000）、Ki67（P＝0．006）經(jīng)統(tǒng)計學分析差異有統(tǒng)計學意義．乳腺癌患者血清miR-21高表達不僅與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki67表達有關(guān)．說明miR-21與乳腺癌的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性．Ki67抗原是一種在增殖細胞中表達的核抗原，能反映腫瘤的增殖活性［19］．Ki67抗原的過量表達與乳腺癌的惡性生物學行為和預后有密切聯(lián)系，并可以作為確定癌前人群中高危個體的生物學標志物．Ki67與miR-21表達的正相關(guān)，預測miR-21在判斷乳腺癌惡性程度、腫瘤的增殖能力、預測高危風險也存在一定價值．

血清miR-21與家族性和三陰性乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，其表達增高對乳腺癌的遺傳性、惡性程度及其預后相關(guān)，具體機制有待探討．至于血清miR-21能否作為該種乳腺癌診斷指標、預測指標和與BRCA1基因突變的關(guān)系有待進一步的研究．

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［責任編輯：陳詠梅］

The expression of serum miR-21 in the patients with familial breast cancer and triple negative breast cancer

CHEN Chong，ZHOU Taoyu，WEN Wangrong
（Center of Clinical Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China）

Aim：To detect differences of serum miR-21 expression in breast cancer patients in order to further clarify the role of miR-21 in the pathogenesis of familial and triple negative breast cancers．Methods：The serum of healthy female volunteers，other types of breast cancer patients and high risk volunteers for breast cancer were collected．The expression levels of miR-21 in sera from 77 patients or volunteers were determined by fluorescence quantitative PCR．And Cel-miR-39 was used as exogenous internal reference．Results：The relative expression level of serum miR-21 was significantly higher in familial breast cancer groups、triple negative breast cancer group and high risk group than that in healthy control group or other breast cancer group（P＜0．01）．The expression of serum miR-21 was associated with lymph nod metastasis and Ki67 expression level（P＜0．01）．The results showed that serum miR-21 of patients with familial and triple-negative breast cancer，and was revelant with lymph node metastasis and Ki67 expression．Conclusion：Serum miR-21 of patients with breast cancer may be associated with hereditary，the degree of malignancy and determination of prognosis．

miR-21；familial breast cancer；triple negative breast cancer；serum；FQ-PCR

R737．9

A

1000－9965（2015）01－0050－07

10．11778／j．jdxb．2015．01．009

2014－11－12

廣東省科技計劃項目（2011B031800315）

陳 崇（1989－），女，技師，研究方向：臨床分子生物學檢驗

溫旺榮，教授，博士生導師，Tel：020－38688430，E-mail：wenwangrong＠yeah．net