吳 順， 郝衛(wèi)強 ， 岳邦毅， 張培培， 狄 斌， 陳 強*

（1. 常州大學石油化工學院，江蘇 常州213164；2. 上海煙草集團有限責任公司，煙草行業(yè)卷煙煙氣重點實驗室，上海200082；3. 常州南京大學高新技術研究院，江蘇 常州213164；4. 中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京210009）

梯度洗脫是高效液相色譜的一種基本操作模式。它通過在輸液系統(tǒng)中設定梯度程序（即梯度曲線），從而使流動相組成（通常表示為強洗脫溶劑在流動相中的體積比，φ）在分離過程中隨時間的改變而發(fā)生變化［1-3］。在梯度液相色譜（gradient liquid chromatography，GLC）中，色譜峰不僅會受到軸向擴散等傳質(zhì)因素的影響而發(fā)生展寬（即“譜帶展寬效應”），而且還會受到梯度曲線的影響而發(fā)生壓縮（即“譜帶壓縮效應”）［4，5］。這兩種效應共存使得對GLC 中峰寬的理論研究要比等度情形復雜許多，而后者僅需要考慮“譜帶展寬效應”所造成的影響。Poppe 等［6］基于平衡擴散色譜模型對GLC 中的峰寬進行了研究。在該研究中，設定溶劑強度為線性：

其中：k 為保留因子，k0和S 為溶劑強度參數(shù)。同時，色譜柱的理論塔板高度（H）被假定不會隨流動相組成的改變而發(fā)生變化。需要指出，這些假設在實踐中均具有一定的局限性。為了拓展Poppe 等的工作，Guiochon 等［7-10］將非線性溶劑強度以及溶劑在固定相上的吸附引入到數(shù)學分析之中，在此基礎上探討了單線性梯度洗脫中的譜帶壓縮因子的計算方法。本文作者以速率色譜模型為理論基礎，推導得到適合任意形式的溶劑強度、梯度曲線以及Hφ 關系的理論塔板高度方程［11］：

其中：Hap為GLC 中的表觀理論塔板高度，H 為等度模式下的理論塔板高度，k 為保留因子，L 為柱長，σ為色譜峰的標準偏差，tR為保留時間，t0為死時間，tD為梯度延遲時間，k 和H 中的下標為其所對應的流動相組成，φ0為初始流動相組成，Φ（t）為梯度曲線表達式，φR為溶質(zhì)流出色譜柱時所對應的流動相組成（即φR＝Φ（tR-t0-tD））。作者［12］發(fā)現(xiàn)式（2）同樣適用于平衡擴散色譜模型，這就為式（2）在實踐中的應用奠定了良好的理論基礎。

在實踐中，線性梯度和階梯梯度是梯度曲線的兩種基本形式。通過改變線性梯度的斜率，以及將線性梯度和階梯梯度以任意形式組合，可衍生出眾多具有不同形狀的梯度曲線，從而極大地增加了實際梯度操作的靈活性。然而，由于輸液系統(tǒng)中溶劑的混合以及受到管線中軸向擴散等因素的影響，線性梯度和階梯梯度在曲線的拐角處將不可避免地出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，這就會使實際梯度曲線與設定形狀之間存在一定差異。為了探討這種梯度曲線變形對色譜峰寬的影響，本文以反相液相色譜體系為研究對象，基于所設定的梯度條件以及在柱入口處測得的梯度曲線，根據(jù)由式（2）推導得到的線性、階梯以及任意線性梯度組合的數(shù)學公式，對GLC 中的色譜峰寬進行計算。然后比較理論值與實驗值之間的差異，探討了梯度曲線變形對色譜峰寬的影響。

1 理論部分

對于階梯梯度（本文均假定溶質(zhì)在最后一個梯度區(qū)間內(nèi)流出色譜柱）：

其中：tP，1為流動相組成發(fā)生變化所對應的時間。當溶劑強度為線性（即符合式（1）），且H-φ 的關系符合拋物線方程：

由式（2）可推導得到式（5）［11］：

類似地，對于具有如下形式的線性梯度：

其中：B2為梯度的斜率，tP，1和tP，2為梯度曲線發(fā)生兩次轉向所對應的時間。由式（2）可推導得到式（7）［11］：

其中：數(shù)學函數(shù)I（φ1，φ2，n）定義為：

對于在色譜柱入口處測得的梯度曲線，其可以看作是由一組線性梯度首尾相連而成，即：

其中：tP，0＝0，N 為溶質(zhì)流出色譜柱時所對應的梯度區(qū)間的編號（即tR-t0∈（tN-1，tN）），tP，i-tP，i-1等于色譜工作站記錄數(shù)據(jù)的時間間隔。相應地，式（2）可寫為式（10）（該情形中tD＝0）［11］：

其中：

色譜峰寬（W）與Hap的關系為：

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

日本島津公司Prominence 液相色譜系統(tǒng)，包括兩個LC-20AT 輸液泵，一臺SIL-20A 自動進樣器，一臺SPD-20A 紫外檢測器，一個CTO-20AC 柱溫箱，以及LabSolutions 色譜工作站等。

聯(lián)苯（純度99%）和苯乙酮（純度99%）均購自常州潤友商貿(mào)公司。Ultimate XB C18 色譜柱購自月旭材料科技（上海）有限公司。甲醇為色譜純。試驗用水為超純水。

2.2 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：5 μL。流動相：甲醇和水，流速：1.0 mL／min，梯度曲線中各節(jié)點對應的時間和甲醇體積分數(shù)（φ）見表1。

表1 聯(lián)苯和苯乙酮的梯度洗脫條件Table 1 Gradient conditions for biphenyl and acetophenone

2.3 實驗步驟

樣品溶液的配制：取聯(lián)苯和苯乙酮適量，用60% （v／v）甲醇水溶液分別配成20 mg／L 和30 mg／L 的樣品溶液。

死時間和梯度延遲時間的測定：同文獻［13］。

柱入口處梯度曲線的測定：以二通管替換色譜柱，并將檢測波長設定為205 nm。首先，記錄不同甲醇體積分數(shù)的流動相在該波長下的響應值，繪制校準曲線。然后，在表1 所示的梯度條件下記錄檢測器的響應值隨時間的變化曲線。根據(jù)校準曲線將響應值換算成甲醇的比例。

色譜峰寬的測定：在表1 所示的梯度條件下記錄聯(lián)苯和苯乙酮的色譜峰，峰寬從色譜工作站的處理結果中獲得（即USP 峰寬）。

3 結果與討論

圖1 （a）聯(lián)苯和（b）苯乙酮的lnk-φ 和H-φ 曲線Fig.1 Plots of lnk-φ and H-φ for （a）biphenyl and （b）acetophenone

實驗中首先通過等度洗脫考察了聯(lián)苯和苯乙酮在不同甲醇體積分數(shù)條件下的出峰情況，實驗結果見圖1。由圖1 可見，lnk 和H 與流動相中甲醇體積分數(shù)的關系可分別通過式（1）和式（4）進行描述。另外，理論塔板高度隨流動相組成的改變而發(fā)生了明顯變化。這是因為一些與傳質(zhì)過程相關的物理參數(shù)，如流動相的黏度等會隨著流動相中甲醇體積分數(shù)的改變而發(fā)生變化。這一結果表明，當計算GLC中的色譜峰寬時，流動相組成對理論塔板高度的影響也必須考慮在內(nèi)。

圖2 是實驗測得的柱入口處的甲醇體積分數(shù)隨時間的變化曲線。由圖2 可見，在梯度曲線的拐角處，曲線的形狀均發(fā)生了不同程度的彌散化，而這在階梯梯度（圖2b）以及斜率較高的線性梯度（圖2a中最左側的曲線）中表現(xiàn)得尤為明顯。梯度曲線形狀的改變是由于溶劑在混合器中的混合以及受到在管線中軸向擴散等因素的影響，導致甲醇體積分數(shù)的實際值與設定值之間產(chǎn)生了偏差。而這種偏差會使梯度曲線的形狀呈現(xiàn)出非線性的特點，從而勢必會對溶質(zhì)譜帶的寬度產(chǎn)生影響。

圖2 柱入口處測得的梯度曲線Fig.2 Gradient profiles obtained at column inlet

為了考察上述梯度曲線變形對色譜峰寬的影響，我們分別基于在輸液系統(tǒng)中設定的梯度曲線（即表1）以及在柱入口處測得的梯度曲線，計算得到色譜峰寬的理論值，并將這些理論值與實驗值進行了比較，結果見表2。

從表2 可以看到，當將梯度曲線變形的影響考慮在內(nèi)后，計算得到的峰寬的理論值（即Theoretical value 2 一欄）比未考慮梯度曲線變形影響的理論值（即Theoretical value 1 一欄）更接近于實驗值。另外，在階梯梯度中，當初始和終止流動相的比例相差較小時（如苯乙酮中第1 至4 項實驗），梯度曲線變形對色譜峰寬計算的影響較小，即表2 中Theoretical value 1 與Theoretical value 2 的值以及與實驗值的差異不大；而當初始和終止流動相的比例相差較大時（如苯乙酮中第5 和第6 項實驗），基于設定的梯度曲線計算得到的理論值與實驗值之間差異明顯；當將梯度曲線變形的影響考慮在內(nèi)后，這種差異顯著降低。上述結果表明，GLC 中梯度曲線的變形會對色譜峰寬產(chǎn)生影響。當梯度曲線中的流動相組成在短時間內(nèi)出現(xiàn)顯著變化時，梯度曲線變形對色譜峰寬的影響就需要考慮在內(nèi)。另外，圖2b 中柱入口處測得的梯度曲線呈現(xiàn)一種S 型的非線性特征。由該曲線計算得到的峰寬理論值要小于相應階梯梯度條件下的理論值。這一結果暗示非線性的梯度曲線將有助于獲得更窄的色譜峰寬。目前，許多商品化的液相色譜儀都具備非線性梯度設定的功能，然而實踐中非線性梯度洗脫的應用還不是很多。本文的研究將為今后非線性梯度條件的選取以及優(yōu)化打下基礎。

表2 不同梯度洗脫條件下色譜峰寬的理論值與實驗值的比較Table 2 Comparison of theoretical and experimental values of peak width under different gradient conditions

4 結論

本文研究了GLC 中梯度曲線變形對色譜峰寬的影響。研究結果表明，在階梯梯度以及斜率較高的線性梯度中，實際的梯度曲線形狀會與設定形狀之間存在較大差異，而這種差異將會對色譜峰寬產(chǎn)生影響。因此，當梯度曲線中存在類似的形狀時，在計算色譜峰寬時需要將梯度曲線變形的影響考慮在內(nèi)。另外，柱入口處的梯度曲線呈現(xiàn)出S 型的非線性特征；基于該曲線計算得到的峰寬理論值要小于相應階梯梯度條件下的理論值。這一結果暗示了非線性梯度洗脫在實踐應用中的潛在價值。

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