朱　鑫，易　潭，陳　琳，吳　萍，汪建華，陳　韜，張建社，褚武英

(1. 長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系，中國 長沙　410003；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，中國 長沙　410128)

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翹嘴鱖miR-146a在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)及溫度對(duì)其表達(dá)的影響

朱鑫1, 2#，易潭1,2#，陳琳1，吳萍1，汪建華1，陳韜2，張建社1，褚武英1

(1. 長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系，中國 長沙410003；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，中國 長沙410128)

摘要為了解翹嘴鱖胚胎發(fā)育中miR-146a的表達(dá)規(guī)律以及溫度對(duì)miR-146a表達(dá)的影響，將翹嘴鱖受精卵分別在22 ℃和25 ℃水溫下孵化，并利用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測miR-146a在各個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)．結(jié)果顯示，在22 ℃孵化時(shí)，miR-146a的表達(dá)在原腸期前處于較高水平且各時(shí)期表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05)，在尾芽期后出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05)，并在出膜時(shí)達(dá)到最低值；在25 ℃孵化時(shí)，miR-146a的表達(dá)直到神經(jīng)胚期仍處于較高水平且各時(shí)期表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05)，發(fā)育進(jìn)入尾芽期后表達(dá)顯著降低(P<0.05)，在肌效期達(dá)到最低值；miR-146a在25 ℃水溫孵化時(shí)的表達(dá)較22 ℃孵化同時(shí)期的表達(dá)都出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)．研究表明，miR-146a可能主要在胚胎發(fā)育后期起到調(diào)控胚胎發(fā)育的作用，在尾芽期后通過下調(diào)表達(dá)來促進(jìn)胚胎的發(fā)育；并且溫度能影響miR-146a的表達(dá)，溫度升高會(huì)降低miR-146a在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)，將有利于胚胎的發(fā)育．

關(guān)鍵詞翹嘴鱖；miR-146a；發(fā)育性表達(dá)；胚胎發(fā)育；溫度調(diào)節(jié)

ExpressionAnalysisofSiniperca ChuatsiMiR-146aDuringEmbryonic

上世紀(jì)80年代，隨著鱖魚人工繁殖獲得成功，我國開始大規(guī)模推廣鱖魚養(yǎng)殖，使之成為我國主要名貴養(yǎng)殖魚類之一．翹嘴鱖因其肉質(zhì)細(xì)嫩而鮮美，無小刺，且富含蛋白質(zhì)，現(xiàn)已成為水產(chǎn)品市場的緊俏商品和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要品種[1]．深入探索翹嘴鱖的發(fā)育機(jī)制能夠?yàn)轸~類發(fā)育生物學(xué)研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一些有價(jià)值的參考資料．

microRNA(miRNA) 是真核生物中一類進(jìn)化上保守的參與調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小分子RNA．它通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)來促進(jìn)靶mRNA降解或翻譯抑制，在基因表達(dá)中起著負(fù)調(diào)控作用[2-3]．miRNA在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生和新成代謝等一系列生物過程中發(fā)揮重要的作用[4-5]，但是有關(guān)miRNA在胚胎的表達(dá)特性及其在魚類早期發(fā)育中的功能研究還很少．早期的研究表明miRNA對(duì)胚胎發(fā)育起到重要作用．鼠和人的胚胎干細(xì)胞在發(fā)育形成胚胎小體時(shí)，胚胎干細(xì)胞中一些特定的miRNA的表達(dá)會(huì)下調(diào)[6-7]，缺失miRNA的鼠和斑馬魚胚胎在原腸胚形成、神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)形成時(shí)出現(xiàn)發(fā)育畸形甚至停滯[8-9]．Kuang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠與Numb基因的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，并且驗(yàn)證了miR-146a能夠抑制Numb的表達(dá)，而Numb調(diào)控的靶基因Notch參與一系列胚胎發(fā)育和形態(tài)形成過程，如成肌細(xì)胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和體節(jié)形成[11]，因此可以推斷miR-146a很可能參與調(diào)控胚胎的發(fā)育．

水溫可以改變胚胎發(fā)育所需時(shí)間，較高的孵化溫度能加速魚類胚胎的發(fā)育速率，縮短孵化所需的時(shí)間[12]．何利君[13]的研究顯示，翹嘴鱖胚胎發(fā)育在21，25和27 ℃下，分別經(jīng)過74.05，56.73和48.37h孵育后出膜．在適宜溫度范圍內(nèi)，適當(dāng)升溫可以加快胚胎發(fā)育的進(jìn)程，但miRNA是否參與到水溫影響翹嘴鱖胚胎發(fā)育的分子機(jī)制中尚不明確．在本研究中，我們分別在22和25℃水溫下孵化翹嘴鱖的受精卵，并利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測miR-146a在幾個(gè)重要發(fā)育階段的表達(dá)，以此了解miR-146a在胚胎發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)模式及水溫對(duì)miR-146a表達(dá)的影響．

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)用親魚為湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所無病無傷、體格健壯、性腺成熟度好的翹嘴鱖，雌性個(gè)體為體質(zhì)量1.0kg以上的2～4齡魚，雄性個(gè)體為體質(zhì)量0.75kg以上的2～4齡魚．

1.2方法

1.2.1不同溫度下胚胎的孵化和取樣使用寧波市激素制品有限公司生產(chǎn)的絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體生成素釋放激素類似物和鯉鯽魚腦垂體(PG)對(duì)親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，操作方法參考劉希良[14]等文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)．將受精卵置于直徑15cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放200～300顆，分別在22 ℃和25 ℃的水溫中孵化．期間，每半小時(shí)更換一次曝氣水以保證溶氧充足．自受精后定時(shí)將翹嘴鱖魚卵置于顯微鏡下觀察翹嘴鱖胚胎的發(fā)育進(jìn)程，當(dāng)所有魚卵半數(shù)以上達(dá)到某個(gè)時(shí)期時(shí)確定為到達(dá)該時(shí)期．當(dāng)受精卵進(jìn)入二細(xì)胞、囊胚、原腸、神經(jīng)、尾芽、肌效、心搏、出膜期時(shí),分別取適量受精卵置于裝有Trizol的2mL離心管中，每個(gè)時(shí)期取5管平行樣，置于-20 ℃冰箱保存．

1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成保存于Trizol中的受精卵用破口槍頭吸打數(shù)次，直至胚胎全部破碎，然后置于裝有1mLTrizol的離心管中．總RNA提取流程參照TrizolReagent(Invitrogen)說明書操作．所有總RNA樣品分別取1μL作為模板，按照OneStepPrimeScriptmiRNAcDNAsynthesisKit試劑盒(寶生物公司，大連)的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA第一鏈，于4 ℃冰箱保存待用．

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量檢測miR-146a的表達(dá)根據(jù)Chu等[15]建立的鱖魚miRNA文庫，設(shè)計(jì)miR-146a特異性的上游引物，以管家基因β-actin作為胚胎發(fā)育階段樣品的內(nèi)參基因[16]．用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物，引物由上海鉑尚生物公司合成 (見表1)．取2μL逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板，加入12.5μLSYBRPremixExTaqⅡ (寶生物公司, 大連)，1μL特異性的上游引物和1μL通用下游引物(Uni-miRqPCRPrimer, 10μmol/L, 寶生物公司)， 8.5μL的無菌水，總體積25μL，擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-RadCFX96system(USA)上進(jìn)行．?dāng)U增條件為：(1)95 ℃預(yù)變性60s；(2)擴(kuò)增和定量，95 ℃變性5s，60 ℃退火和延伸25s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)．(3) 繪制融解曲線(65～95 ℃，每0.1 ℃檢測一次熒光值)．

表1　熒光定量檢測用引物

注：miR-146a定量所使用的下游引物為通用引物，序列未公布，購自寶生物工程(大連)有限公司(濃度：10μmol/L)．

1.2.4數(shù)據(jù)處理相對(duì)表達(dá)結(jié)果計(jì)算公式為R=2-ΔΔCt，其中Ct值為PCR反應(yīng)循環(huán)閾值，ΔΔCt的計(jì)算公式為：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組．采用SPSS12.0軟件對(duì)所得相對(duì)表達(dá)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA)，并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較(P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示差異極顯著)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE，n=5)表示．

2結(jié)果與分析

2.1miR-146a在胚胎發(fā)育性表達(dá)

有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在不同的細(xì)胞和不同的發(fā)育階段有差異性的表達(dá)，并且它們參與細(xì)胞的生長、分化以及凋亡等過程[17-18]．目前miRNA在魚類胚胎發(fā)育階段的表達(dá)研究還較少，且暫未有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-146a在魚類胚胎的發(fā)育性表達(dá)．圖1結(jié)果顯示，胚胎在22 ℃水溫孵化下，miR-146a的表達(dá)在發(fā)育早期處于較高水平，其中原腸期前的各時(shí)期表達(dá)沒有顯著性差異，進(jìn)入尾芽期后顯著性地降低，并持續(xù)降低，在出膜期時(shí)達(dá)到最低水平．而在25 ℃孵化時(shí)，miR-146a的表達(dá)在神經(jīng)期前處于較高水平且各時(shí)期都沒有顯著性差異，在尾芽期顯著性地降低，在肌效期達(dá)到最低值，心搏期和出膜期處于較低水平并且之間沒有顯著性差異(圖1)．

圖1　miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)情況．A和B分別為miR-146a在22 ℃和25 ℃水溫孵化下不同時(shí)期的發(fā)育性表達(dá)．相對(duì)表達(dá)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=5)．不同的字母代表存在顯著性差異(P<0.05)Fig.1　Detection of miR-146a expression at different embryonic developmental stages. A, B represent miR-146a expressed at different embryonic developmental stages when incubation under 22 ℃and 25 ℃ water temperature, respectively. Values are the mean ±SE, n=5. The different letters indicate significant differences between columns (P<0.05)

2.2miR-146a在不同溫度孵化下的差異性表達(dá)

圖1的結(jié)果顯示溫度影響了miRNA在胚胎發(fā)育中的表達(dá)．當(dāng)比較胚胎發(fā)育同一時(shí)期在22 ℃和25 ℃水溫孵化下miR-146a的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-146a在25 ℃水溫孵化時(shí)的表達(dá)較22 ℃孵化下同時(shí)期的表達(dá)都出現(xiàn)顯著性地降低，其中除出膜期外，其他時(shí)期的表達(dá)差異極顯著(P<0.01)(圖2)．

圖2　miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同水溫孵化下，同一時(shí)期的差異性表達(dá)．每個(gè)時(shí)期均以22 ℃孵化下的表達(dá)值作為對(duì)照，*代表顯著性差異(P<0.05)，**代表差異極顯著(P<0.01)Fig.2　The contrastive expression of miR-146a incubated under different water temperature. The data was expressed as the relative change compared with the expression level of each stage incubated under 22 ℃, asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05), double asterisk (**) indicates significance at P<0.01

3討論

miR-146a最初被發(fā)現(xiàn)在miRNA中參與天然免疫應(yīng)答，當(dāng)單核細(xì)胞受到細(xì)菌內(nèi)毒素侵襲時(shí)，miR-146a的表達(dá)顯著上調(diào)[19]．近年來許多文獻(xiàn)報(bào)道，miR-146a調(diào)節(jié)的許多靶基因參與了細(xì)胞分化的作用，但這些研究主要集中在分析miR-146a對(duì)造血細(xì)胞的分化作用，而miR-146a對(duì)胚胎發(fā)育的作用暫未見到相關(guān)報(bào)道．Kuang等[10]的研究驗(yàn)證了miR-146a能夠抑制Numb的表達(dá)．Numb是一種進(jìn)化保守蛋白，其作為內(nèi)源性細(xì)胞命運(yùn)決定因子，對(duì)細(xì)胞分裂的命運(yùn)起決定作用．Numb對(duì)胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育作用也已經(jīng)被證明[20-21]．Numb作為一個(gè)重要的細(xì)胞命運(yùn)決定蛋白，參與Notch的負(fù)性調(diào)控，兩者的平衡決定了細(xì)胞分化的方向[22]．Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為生物發(fā)育分化中高度保守的通路，通過與配體的相互作用產(chǎn)生級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)，參與細(xì)胞發(fā)育過程中分化方向的選擇，并對(duì)細(xì)胞的增殖及凋亡也起著重要的作用[23-24]．Notch信號(hào)通路在胚胎發(fā)育中起到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和決定細(xì)胞命運(yùn)的作用[25]．激活Notch信號(hào)能夠促進(jìn)肌原細(xì)胞的增殖，并降低MyoD和myogenin的表達(dá)來延遲成肌細(xì)胞的分化[26]．miR-146a及其靶基因的研究為進(jìn)一步了解miR-146a在胚胎發(fā)育中潛在的作用提供了一些重要的理論依據(jù)．

翹嘴鱖miR-146a胚胎發(fā)育性表達(dá)結(jié)果顯示，在22 ℃和25 ℃水溫孵化下，miR-146a表達(dá)規(guī)律趨勢總體相似，但在不同溫度下，miR-146a的表達(dá)在幾個(gè)時(shí)期經(jīng)歷了微調(diào)，說明溫度確實(shí)影響了miR-146a的表達(dá)．本文結(jié)果顯示在胚胎發(fā)育早期(二細(xì)胞到神經(jīng)胚期)miR-146a的表達(dá)趨于穩(wěn)定且處于較高水平(除22 ℃神經(jīng)胚期有顯著性上升)，在進(jìn)入尾芽期后表達(dá)都顯著性地降低．Giraldez等[27]的研究表明miRNA的作用并不是在發(fā)育早期決定細(xì)胞的命運(yùn)而是影響發(fā)育后期組織的發(fā)育和形成，而在神經(jīng)胚期前胚胎的大部分組織器官還未開始分化，本文結(jié)果與Giraldez等的結(jié)論相符．胚胎發(fā)育經(jīng)過神經(jīng)胚期后，是器官形成的主要階段，而本文結(jié)果顯示miR-146a的表達(dá)在尾芽期顯著降低，表明miR-146a的靶基因在這個(gè)階段后受到其抑制作用將明顯降低，并推測miR-146a的靶基因的作用可能是促進(jìn)胚胎發(fā)育的．Kuang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Numb是miR-146a的靶基因，Numb能夠促進(jìn)胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育[20-21]，Numb參與調(diào)節(jié)的Notch信號(hào)通路也對(duì)胚胎的發(fā)育起到重要的作用．

溫度是影響魚類胚胎發(fā)育的一個(gè)主要的外在因子．大量研究表明，在適宜溫度下，隨著水溫的升高，胚胎的發(fā)育進(jìn)程加快，孵化所需時(shí)間縮短[28-29]，但是miRNA的表達(dá)是否受到溫度的影響還未見相關(guān)報(bào)道．從圖2可以看出，在25 ℃孵化時(shí)，miR-146a在不同階段的表達(dá)都比22 ℃時(shí)出現(xiàn)顯著性降低．這一結(jié)果表明溫度升高能降低miR-146a的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育．有研究表明肌纖維增生和增粗的速率在較高的水溫孵化時(shí)都會(huì)升高，但是溫度對(duì)肌纖維的增粗效果強(qiáng)于增生[5]．在25 ℃孵化時(shí)，miR-146a的表達(dá)顯著性降低能增強(qiáng)Numb對(duì)Notch信號(hào)通路的抑制作用，促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，從而有利于胚胎中肌肉組織形成．這一結(jié)果表明了miR-146a在參與水溫調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的過程中是通過下調(diào)來促進(jìn)發(fā)育的．

4結(jié)論

研究表明，miR-146a在胚胎發(fā)育早期(神經(jīng)期前)的作用不明顯．在胚胎發(fā)育后期(尾芽期至出膜)，miR-146a通過下調(diào)其表達(dá)來促進(jìn)胚胎的發(fā)育．而水溫升高能顯著降低miR-146a在胚胎發(fā)育每個(gè)時(shí)期的表達(dá)，減少其對(duì)靶基因Numb的抑制，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞分化的作用，從而有利于胚胎發(fā)育的進(jìn)程．

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(編輯王健)

DevelopmentandEffectofTemperatureonMiR-146aExpression

ZHU Xin1,2#, YI Tan1,2#, CHEN Lin1,WUPing1,WANGJian-hua1,

CHEN Tao2,ZHANGJian-she1, CHU Wu-ying1*

(1.DepartmentofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ChangshaUniversity,Changsha410003,China;

2.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgricultureUniversity,Changsha410128,China)

AbstractTo investigate the expression pattern of miR-146a in embryonic developmental stage and the effect of temperature on the expression of miR-146a in Siniperca chuatsi, the embryos were incubated under different temperatures and the expression of miR-146a during embryonic developmental stage was detected by RT-qPCR. The results showed that the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference before gastrula stage when the embryos incubated under 22 ℃ (P>0.05). And then the expressions of miR-146a decreased after tail-bud stage and decreased to the lowest level at larval stage (P<0.05). When the embryos incubated under 25 ℃, the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference till neurula stage (P>0.05). Once at tail-bud stage, the expression of miR-146a significantly decreased (P<0.05) and to the lowest level at muscular effect stage. It was interesting that the expressions of miR-146a were significantly decreased at each developmental stage incubated under 25 ℃ when compared with 22 ℃ incubation (P<0.05). The results indicated that miR-146a mainly involved in regulating embryonic development during later embryonic developmental stages and promoted embryonic development by down regulation its expression. In addition, the expressions of miR-146a could decrease when the incubation temperature increased, and miR-146a might involve in the effect of temperature on embryonic development of Siniperca chuatsi.

Key wordsSiniperca chuatsi; miR-146a; developmental expression; embryonic development; temperature regulation

中圖分類號(hào)Q752; S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1000-2537(2015)05-0021-06

通訊作者*,E-mail：chuwuying18@sina.com

基金項(xiàng)目：#本文同等貢獻(xiàn)作者.

收稿日期：2014-12-15

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.05.004