宋志峰，陳冠寧，魏春雁，樊慧梅，劉笑笑

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所／農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130033；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春 130021)

土壤中的汞主要以元素汞(Hg)、無(wú)機(jī)汞離子化合物(Hg+，Hg2+)、有機(jī)汞(MeHg+和EtHg2+)等形態(tài)存在。農(nóng)田土壤中汞除了自然本底以外，另外一個(gè)重要來(lái)源是含汞及有機(jī)汞的農(nóng)藥、殺菌劑或者種子處理劑等的大量使用。汞的形態(tài)不同其毒性也各不相同，有機(jī)汞的毒性比無(wú)機(jī)汞強(qiáng)，尤以甲基汞的毒性最強(qiáng)，乙基汞次之，且甲基汞和乙基汞容易被生物體吸收，并通過(guò)食物鏈的富集最終進(jìn)入人體，其代謝周期長(zhǎng)，即使劑量很少也能積累致毒。近些年，隨著重金屬形態(tài)研究的不斷發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到只進(jìn)行重金屬的總量檢測(cè)與評(píng)估意義并不大，只有對(duì)重金屬的形態(tài)和總量同時(shí)進(jìn)行分析才能正確評(píng)價(jià)重金屬的污染程度及潛在風(fēng)險(xiǎn)，才能制定出科學(xué)合理的預(yù)防和治理措施，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

汞形態(tài)分析的前處理方法有汞化合物的萃取富集方法［1-8］和衍生化方法［9-10］等；測(cè)定方法主要有光譜法［11］、毛細(xì)管泳法(CE)［12］、氣相色譜法(GC)［13］、高效液相色譜法(HPLC)［14］及聯(lián)用技術(shù)(GC-AFS，GC-AAS，CE-AFS，GC-MS，GC-ICPTOFMS，HPLC-ICP-MS和HPLC-AFS等)［4，15-19］。其中聯(lián)用技術(shù)由于具有較高的分離能力和靈敏度而成為汞形態(tài)分析中的主要技術(shù)。以往報(bào)道的方法中存在最大的問(wèn)題是樣品處理過(guò)于繁瑣，使用GC方法分離時(shí)往往需要衍生；HPLC分析要經(jīng)過(guò)反復(fù)萃取與反萃取，測(cè)定難度較大并容易引入人為誤差。筆者經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，建立了超聲波輔助的硝酸溶液萃取、HPLC-ICP-MS聯(lián)用測(cè)定農(nóng)田土壤中甲基汞和乙基汞的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有樣品處理簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、檢出限低、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：7500Cx型，美國(guó)Agilent科技有限公司；

高效液相色譜儀：1100型，美國(guó)Agilent科技有限公司；

分析天平：(1)BT124S型，感量為0.000 1 g，德國(guó)Sartorius公司，(2)DL202-L型，感量為0.001 g，梅特勒-托利多上海有限公司；

離心機(jī)：DL-6000B型，轉(zhuǎn)速為4 000 r／min，上海安亭科學(xué)儀器廠；

超聲波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

L-半胱氨酸鹽酸鹽、β-巰基乙醇：分析純；

硝酸：優(yōu)級(jí)純，體積分?jǐn)?shù)為38%；

2%硝酸溶液：量取38%硝酸1 mL與18 mL水混合；

氨水：體積分?jǐn)?shù)為28 %～29 %；

甲醇：色譜純；

氯化甲基汞標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 115-09-3，純度大于98.5%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

氯化乙基汞標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 107-27-7，純度大于98.0%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

質(zhì)譜調(diào)諧液：推薦選用含有鈷(Co)、釔(Y)、鉈(Tl)元素的質(zhì)譜調(diào)諧液，調(diào)諧液濃度為儀器生產(chǎn)商推薦濃度，介質(zhì)為2%硝酸溶液；

甲基汞、乙基汞混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：質(zhì)量濃度均為1 000 mg／L。準(zhǔn)確稱取氯化甲基汞、氯化乙基汞標(biāo)準(zhǔn)品各1 000.0 mg，用2%硝酸溶液溶解并定容至1 000 mL，于0～4℃冰箱中儲(chǔ)存，有效期為3個(gè)月；

甲基汞、乙基汞混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為0.1 mg／L。吸取適當(dāng)體積的氯化甲基汞、氯化乙基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水逐級(jí)稀釋，于0～4℃冰箱中儲(chǔ)存，有效期為1個(gè)月；

甲基汞、乙基汞系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用移液管分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.10，0.50，5.0，25，50.0 mL于6只100 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，混勻。兩種有機(jī)汞質(zhì)量濃度均為0，0.000 1，0.000 5，0.005，0.025，0.050 μg／mL，現(xiàn)用現(xiàn)配；

土壤樣品：采自吉林省磐石市、蛟河市、輝南縣、樺甸市和撫松縣5個(gè)地區(qū)的玉米大田；

除另有說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水符合GB／T 6682中一級(jí)水的要求；

實(shí)驗(yàn)所用的玻璃器皿均需用20%硝酸浸泡12 h以上，用水反復(fù)沖洗干凈。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 HPLC條件

色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：5 mmol／L乙酸銨與3.8 mmol／L L-半胱氨酸鹽酸鹽混合溶液-甲醇(95∶5)［先加入適量濃氨水，再用氨水溶液(10∶90)調(diào)pH至7.5，流動(dòng)相現(xiàn)用現(xiàn)配，使用時(shí)間不超過(guò)24 h］；流量：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：100 μL；色譜分離中需保證甲基汞、乙基汞的分離度不小于2.0。

1.2.2 ICP-MS條件

使用玻璃同心霧化器；石英霧化室、矩管；Ni采樣錐、截取錐；采樣模式：Time program；同位素：202Hg積分時(shí)間：0.5 s。在無(wú)碰撞氣模式下，使用質(zhì)譜調(diào)諧液對(duì)儀器工作狀態(tài)進(jìn)行優(yōu)化，調(diào)諧參數(shù)見(jiàn)表1，優(yōu)化后的狀態(tài)指標(biāo)見(jiàn)表2。

表1 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀調(diào)諧參數(shù)

表2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀調(diào)諧指標(biāo)

1.3 樣品處理

選取具有代表性的農(nóng)田土壤樣品(不少于500 g)，混勻后用四分法縮分至約100 g，風(fēng)干，除去樣品中石塊和動(dòng)植物殘?bào)w等異物，用瑪瑙研缽研磨，全部通過(guò)0.150 mm尼龍篩。

稱取制備的試樣約5.0 g(精確至0.01 g)于離心管中，緩慢加入0.5 mol／L硝酸溶液20 mL，邊加邊攪拌至不產(chǎn)生氣泡為止，超聲提取1.0 h，以4 000 r／min離心5 min，吸取上層澄清溶液5.00 mL于25 mL燒杯中，用氨水溶液(10∶90)調(diào)pH值到7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水定容至標(biāo)線，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相考察

對(duì)L-半胱氨酸鹽酸鹽和巰基乙醇兩種流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用巰基乙醇甲基汞和乙基汞的保留時(shí)間明顯縮短，可節(jié)省分析時(shí)間。但是靈敏度和重現(xiàn)性與L-半胱氨酸鹽酸鹽流動(dòng)相體系相比較差，綜合考慮，使用L-半胱氨酸鹽酸鹽流動(dòng)相體系。流動(dòng)相pH對(duì)兩種有機(jī)汞的峰形有一定影響，當(dāng)體系偏酸性時(shí)，峰高變??；當(dāng)pH＞7.0時(shí)，峰高增大，有助于提高分析靈敏度。經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比，確定流動(dòng)相pH為7.5。流動(dòng)相中甲醇的比例增加時(shí)，有助于兩種有機(jī)汞的洗脫，但隨著甲醇比例的增加，造成碳在采樣錐上的累積，不但使靈敏度降低還容易使ICP-MS熄火。在分析時(shí)間可接受的情況下，選擇甲醇的比例為5%。按1.2儀器工作條件，對(duì)甲基汞和乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，總離子流圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，兩種有機(jī)汞得到良好分離。

圖1 甲基汞、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流圖

2.2 樣品前處理方法

2.2.1 提取溶劑

在空白樣品中加入適當(dāng)濃度的甲基汞、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，使最終測(cè)定液中甲基汞、乙基汞的質(zhì)量濃度分別為10，6.47 ng／mL。分別以0.1，0.5，1，2，6 mol／L的HCl和HNO3溶液為甲基汞和乙基汞的提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HCl和HNO3溶液的提取效率相當(dāng)?？紤]到HNO3溶液的基體效應(yīng)較小，因此選擇HNO3溶液為提取溶劑。當(dāng)HNO3溶液的濃度達(dá)到0.5 mol／L后，提取率不再增加，因此選擇HNO3提取劑的濃度為0.5 mol／L。

2.2.2 提取方式

在空白樣品中加入適當(dāng)濃度的甲基汞、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，使最終測(cè)定液中甲基汞、乙基汞的質(zhì)量濃度分別為10，6.47 ng／mL。使用0.5 mol／L HNO3溶液為提取溶劑，比較了室溫振蕩提取1，2，3，4，5 h和超聲波提取0.5，1，1.5，2 h時(shí)甲基汞和乙基汞的提取效率。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)室溫振蕩提取4 h和超聲波提取1 h的提取效率均達(dá)到最大且效率相當(dāng)，因此采用超聲提取1 h的方式。

2.3 樣品提取液穩(wěn)定性

在空白樣品中加入適當(dāng)濃度的甲基汞、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，使最終測(cè)定液中甲基汞、乙基汞的質(zhì)量濃度分別為10，6.47 ng／mL，按1.3方法處理樣品，分別于0，6，12，24，48 h對(duì)提取液進(jìn)行分析，樣品溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，甲基汞、乙基汞提取液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 土壤樣品甲基汞、乙基汞提取液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.4 方法線性和檢出限

將甲基汞、乙基汞系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按1.3方法進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，以兩種有機(jī)汞的響應(yīng)值Y (CPS)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度X (ng／mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。以信噪比S／N=3計(jì)算檢出限。兩種有機(jī)汞的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限見(jiàn)表4。

表4 甲基汞、乙基汞的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

稱取空白樣品12份，按表5所示量加入甲基汞和乙基汞，每個(gè)水平進(jìn)行3次平行測(cè)定，計(jì)算樣品回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，甲基汞、乙基汞的回收率分別為89.26%～94.26%，76.88%～79.27%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.67%～2.38%,2.58%～3.84%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度較高，方法穩(wěn)定可靠。

表5 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.6 樣品測(cè)定

對(duì)采自吉林省磐石市、蛟河市、輝南縣、樺甸市和撫松縣的5份玉米大田土壤樣品進(jìn)行了甲基汞和乙基汞的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 玉米大田土壤中甲基汞、乙基汞的測(cè)定結(jié)果 μg／kg

3 結(jié)語(yǔ)

建立的HPLC與ICP-MS聯(lián)用測(cè)定農(nóng)田土壤中的甲基汞和乙基汞的方法，樣品處理簡(jiǎn)單快速、檢出限低，精密度、準(zhǔn)確度符合準(zhǔn)確定量的要求。該法適合于農(nóng)田土壤中甲基汞和乙基汞的測(cè)定。

［1］West?? G. Determination of methylmercury compounds in foodstuffs.I.Methylmercury compounds in fish，identification and determination［J］. Acta Chem Scand，1966，20(8): 2 131-2 137.

［2］江桂斌，顧曉梅，倪哲明，等.毛細(xì)管氣相色譜-原子吸收法測(cè)定生物樣品中的有機(jī)汞化合物［J］.色譜，1991，9(6): 350-352.

［3］Krishna M V B，Ranjit M，Karunasagr D，et al. A rapid ultrasoundassisted thiourea extraction method for the determination of inorganic and mercury in biological and environmental samples by CVAAS［J］. Talanta，2005，67(1): 70-81.

［4］Nevado J J B，Martin-Doimeadios R C R，Berardo F J G，et al. Determination of mercury species in fish reference materials by gas chromatography-atomic fluorescence detection after closed vessel microwave-assisted extraction［J］. J Chromatogr A，2005，1 093(1-2): 21-28.

［5］Houserova P，Matejicek d，Kuban V. High-performance liquid chromatography／iorr-trap mass spectrometric speciation of aquatic mercury as its pyrrolidinedithiocarbamate complexes［J］. Anal Chim Acta，2007，596(2): 242-250.

［6］Mishra S，Tripathi R M，Bhalke S，et al. Determination methylmercury and mercury(Ⅱ)in a marine ecosystem using solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry［J］. Anal Chim Acta，2005，551(1-2): 192-198.

［7］Gil S，F(xiàn)ragueiro S，Lavilia I，et al. Determination of methylmercury by eletrothermal atomic absorption spectrometry using headspace single-drop micoextraction with in situ hydride generation［J］.Spectrochim Acta (Part B)，2005，60(1): 145-150.

［8］Pvelaa N，Caruso J A. Element selective detection for supercriticalfluid chromatography［J］. J Biochem Biophys Methods，2000，43(1-3): 45-58.

［9］Bravo-Sanchezl R，Encinar J R，Martinezj I F，et al. Mercury speciation analysis in sea water by solid phase microextractiongas chromatograph-inductively coupled plasma mass spectrometry using ethyl and propyl derivatization.Matrix effects evaluation［J］.Spectrochim Acta(Part B)，2004，59(1): 59-66.

［10］Gomez-Ariz J L，Lorenzo F，Garcia-Barrera T，et al. Analytical approach for routine methylmercury determination in seafood using gas chromatography-atomic fluorescence spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2004，551(1): 165-173.

［11］祁輝，劉愛(ài)民，黃業(yè)茹，等.巰基棉富集-毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定環(huán)境水中的甲基汞［J］.中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)，2010，26(4): 33-36.

［12］Medina I，RubíE，Mejuto M C，et al. Speciation of organomercurials in marine samples using capillary electrophoresis［J］. Talanta，1993，40(11): 1 631-1 636.

［13］王喜梅，連寧.巰基棉富集氣相色譜法測(cè)定水中微量甲基汞［J］.青海環(huán)境，1999，9(4): 151-159.

［14］殷學(xué)鋒，徐青.汞的形態(tài)分析研究(2)固相萃取預(yù)富集-液相色譜分離測(cè)定圖通形態(tài)的汞［J］.分析化學(xué)，1995，23(11): 1 305-1 307.

［15］梁淑軒，龐秀言，孫漢文.超短柱氣相色譜與原子吸收聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)化及其在甲基汞形態(tài)分析中的應(yīng)用［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2002，12(3): 262-263.

［16］Chen S S，Chou S S，Hwang D F. Determination of methylmercury in fish using focused microwave digestion following by Cu2+addition，sodium tetrapropylborate derivatization，n-heptane extraction，and gas chromatography-mass spectrometry［J］. J chromatogr.A，2004，1 024(1-2): 209-215.

［17］Jitaru P，Adams F C. Speciation analysis of mercury by solidphase microextraction and multicapillary gas chromatography hyphenated to inductively coupled plasma-time-of-flight-mass spectrometry［J］. J Chromatogr A，2004，1 055(1-2): 197-207.

［18］Wang M，F(xiàn)eng W Y，Shi J W，et al. Development of a mild mercaptoethanol extraction method for determination of mercury species in biological samples by HPLC-ICP-MS［J］. Talanta，2007，71(5): 2 034-2 039.

［19］Liang N，Jiang G B，Liu J F，et al. Speciation analysis of mercury in seafood by using high-performance liquid chromatography online coupled with cold-vapor atomic fluorescence spectrometry via a post column microwave digestion［J］. Anal Chim Acta，2003，477(1): 131-137.