荀其寧，張文申，侯倩倩，許峰，劉運(yùn)峰，劉志娟，冀克儉，王家彬

（中國兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031）

液相色譜廣泛應(yīng)用于大分子化合物、離子型化合物、熱不穩(wěn)定化合物及有機(jī)生物活性化合物的分離與分析［1–2］，已成為生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域必不可少的重要檢測方法［3］。為了保證分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠及可溯源性，必須按照國家檢定規(guī)程對液相色譜儀進(jìn)行檢定，液相色譜儀經(jīng)檢定合格后方可使用。甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要用于液相色譜儀示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器的檢定［4］。由于該溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度低，制備技術(shù)要求較高，制備方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。市場上的甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)不能滿足需求，為此筆者研制了液相色譜檢定用甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電子分析天平：AB135–S型，最大稱量為31 g，分度值0.01 mg，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；

容量瓶：500 mL，A級，經(jīng)檢定合格后使用；

貯存容器：2 mL棕色玻璃安瓿瓶；

氣相色譜儀：7890A型，配有氫火焰離子化檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司；

液相色譜儀：1260型，配有紫外–可見光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司；

膽固醇：一級純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，證書編號為GBW 09203b，純度為99.7%，相對擴(kuò)展不確定度為0.1%(k=2)，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

甲醇：色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：ZORBAX SB–C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5μm)；檢測器：紫外–可見光檢測器；流動(dòng)相：甲醇，流量為1.0 mL／min；分析波長：205 nm；進(jìn)樣體積：20 μL［5］。

2 甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

根據(jù)JJG 705 《液相色譜儀檢定規(guī)程》要求，稱取純度為99.7%的膽固醇國家一級純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100.02 mg至500 mL潔凈容量瓶中，保持環(huán)境溫度為(20±2)℃，用甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，即得甲醇中膽固醇溶液。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值采用重量–容量法，定值結(jié)果為200 μg／mL。配制完成后將溶液分裝到2 mL棕色安瓿瓶內(nèi)，溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)裝量為1.5 mL，分裝總量為280瓶，粘貼標(biāo)簽后冷藏避光保存。對分裝好的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

3 均勻性檢驗(yàn)

采用方差分析法進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)［6–7］。按封裝前后順序，抽取前5瓶、中間5瓶、最后6瓶共計(jì)16瓶樣品，在相同的條件下，采用液相色譜法測定膽固醇的含量。每個(gè)單元重復(fù)測量3次，當(dāng)顯著性水平α=0.05時(shí)，查表得臨界值F0.05，(15，32)=1.97。甲醇中膽固醇均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。由表1數(shù)據(jù)計(jì)算得，組間方差和Q1=2.072 2，組內(nèi)方差和Q2=8.173 7，F(xiàn) =0.54，F(xiàn)

表1 甲醇中膽固醇溶液均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù) μg／mL

4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

穩(wěn)定性是在不同的時(shí)間積累特性值的穩(wěn)定性。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在低溫（4℃）及避光的保存條件下，在2012～2014年間進(jìn)行了24個(gè)月連續(xù)測定。按照前密后疏的時(shí)間間隔［8］，從均勻性檢驗(yàn)合格的剩余單元中隨機(jī)抽取3個(gè)單元即3瓶，采用液相色譜法每支重復(fù)測定3次，計(jì)算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

依據(jù)文獻(xiàn)［6］規(guī)定，用回歸曲線法進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。即以時(shí)間為橫坐標(biāo)，測定值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得直線斜率為β1，對于穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，β1的期望值為零，基于β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差，可用t檢驗(yàn)(自由度為n–2)進(jìn)行判斷：若| β1|

表2 甲醇中膽固醇溶液的穩(wěn)定性考察結(jié)果

5 定值

甲醇中膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用重量–容量法定值，根據(jù)膽固醇的純度值、稱取的質(zhì)量和溶液定容體積確定其特性量值。該標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度按式(1)計(jì)算：

式中：ci——溶質(zhì)i的濃度，μg／mL；

mi——溶質(zhì)的質(zhì)量，μg；

qi——溶質(zhì)的純度，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，%；

V——溶液的體積，mL。

經(jīng)過計(jì)算，甲醇中膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果為200 μg／mL。

6 定值結(jié)果的不確定度

甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果不確定度來源分析及不確定度評定按文獻(xiàn)［9–10］進(jìn)行。

6.1 不確定度的來源

甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的不確定度主要來源有三部分：定值引入的不確定度；溶液的均勻性引入的不確定度；溶液穩(wěn)定性引入的不確定度。

6.2 不確定度的評定結(jié)果

6.2.1 定值引入的不確定度

定值引入的不確定度來源主要是溶質(zhì)膽固醇純度引入的不確定度、天平稱量引入的不確定度和溶液體積引入的不確定度，各分量數(shù)值見表3。由各分量合成得定值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.32%。

表3 定值引入的相對不確定度 %

6.2.2 均勻性引入的不確定度

由表1數(shù)據(jù)計(jì)算得甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2=0.15%。

6.2.3 穩(wěn)定性引入的不確定度

由表2數(shù)據(jù)計(jì)算得甲醇中膽固醇溶液穩(wěn)定性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3=0.46%。

甲醇中膽固醇溶液的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對擴(kuò)展不確定度：U=kuc=2%（k=2）。

7 量值比對

選用國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心生產(chǎn)的二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，與同濃度的甲醇中膽固醇配制溶液物質(zhì)進(jìn)行量值比對，比對結(jié)果見表4。

表4 配制溶液與其它標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值比對結(jié)果

由表4數(shù)據(jù)可知，與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對，甲醇中膽固醇溶液的相對誤差為0.2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其定值的不確定度2%，說明采用重量–容量法配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)其量值是準(zhǔn)確可靠的。

8 結(jié)語

研制的200 μg／mL的甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值準(zhǔn)確，均勻性及穩(wěn)定性良好，可用于液相色譜儀示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器的檢定。

［1］鄭玲，李麗華，郭蔚，等.高效液相色譜法測定食品中的甜蜜素［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2005，15(3): 50–51.

［2］蘇新國，王寧生，蔣躍明，等.食品中金屬元素高效液相色譜檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2006，27(11): 523–528.

［3］宋虎躍，徐國棟，吳勇民.高效液相色譜技術(shù)的應(yīng)用［J］.內(nèi)蒙古石油化工，2007(6): 17–18.

［4］JJG 705–2014 液相色譜儀檢定規(guī)程［S］.

［5］李黎，劉玉峰，唐華澄，等.高效液相色譜法測定食品中的膽固醇［J］.食品科學(xué)，2007，28(4): 289–291.

［6］JJF 1343–2012 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理［S］.

［7］全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì).標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值原則和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理［M］.北京：中國質(zhì)檢出版社，2011.

［8］JJF 1006–1994 一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范［S］.

［9］JJF 1135–2005 化學(xué)分析測量不確定度評定［S］.

［10］國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計(jì)量司組.測量不確定度評定與表示指南［M］.北京：中國計(jì)量出版社，2005.