宋熙熙，金鑫，宗乾收，董杰

(1.嘉興學(xué)院 化學(xué)與紡織工程系，浙江 嘉興 314000;2.嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314000)

卟啉及其衍生化合物廣泛存在于生物體內(nèi)，在光合作用、細(xì)胞攜氧等過程中起到關(guān)鍵的作用，在能量轉(zhuǎn)移方面也有著優(yōu)異的表現(xiàn)，因此在電化學(xué)，靶向藥物等很多領(lǐng)域有巨大的發(fā)展前景。血清白蛋白是動物血漿中含量最豐富的功能蛋白質(zhì)，具有良好的結(jié)合能力，在運(yùn)輸內(nèi)外源物質(zhì)、維持生理功能等方面有重要的意義?？疾爝策c血清白蛋白相互作用的過程有利于認(rèn)清功能蛋白質(zhì)在肌體內(nèi)部儲運(yùn)分子的過程，并通過主要作用力提高其導(dǎo)向的能力，為生物體轉(zhuǎn)運(yùn)、識別和結(jié)合分子奠定相應(yīng)的基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、三羥甲基氨基甲烷、Tris-鹽酸(HCl)均為分析純;四苯基卟啉(H2TPP)，實驗室自制;牛血清白蛋白(BSA)，上海勵瑞生物科技有限公司;實驗用水為二次蒸餾水。

Cary Eclipse 熒光分光光度計;UV2550 紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

配制Tris-HCl 緩沖溶液0.1 mol/L，四苯基卟啉溶液1 ×10－4mol/L，BSA 溶液1 ×10－5mol/L。

四苯基卟啉DMF 溶液，DMF 為參比，掃描紫外光譜，記錄吸光度變化。不同濃度H2TPP 與BSA 溶液混合，稀釋定容，掃描熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為280 nm，記錄熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜

四苯基卟啉在有機(jī)溶劑DMF 中的紫外吸收光譜見圖1。

圖1 四苯基卟啉的紫外光譜曲線Fig.1 The UV spectrum of H2TPP

由圖1 可知，電子從高占據(jù)分子軌道躍遷到最低空軌道，在420 nm 附近產(chǎn)生較強(qiáng)吸收的Soret 帶是由于a1u(π)-eg(π*)躍遷產(chǎn)生的，屬于第二電子激發(fā)態(tài);電子躍遷在500 ～670 nm 區(qū)間出現(xiàn)的4 個弱吸收Q 帶［1］，是由于a2u(π)-eg(π*)躍遷產(chǎn)生的，屬于第一電子激發(fā)態(tài)。并隨著波長的增加，吸收譜帶的相對強(qiáng)度逐漸減弱。

2.2 熒光光譜

在298.15 K 時測得的四苯基卟啉與BSA 的熒光光譜圖見圖2。

圖2 四苯基卟啉對BSA 的熒光猝滅曲線Fig.2 Effect of H2TPP on the fluorescent emission spectra of BSA

由圖2 可知，在350 nm 附近有較強(qiáng)的熒光峰，隨著四苯基卟啉的濃度的增加，BSA 的熒光強(qiáng)度逐漸下降，內(nèi)源熒光有規(guī)律性的發(fā)生猝滅作用。同時，BSA 最大熒光發(fā)射峰位發(fā)生微弱的藍(lán)移，可能是四苯基卟啉與BSA 在基態(tài)時形成了復(fù)合物，可能從一定程度影響功能蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了熒光體系的熒光強(qiáng)度降低而發(fā)生一定的藍(lán)移，從而可能影響蛋白質(zhì)的生理活性。

2.2.1 猝滅作用 引起B(yǎng)SA 內(nèi)源性熒光猝滅的原因可能是由于動態(tài)或靜態(tài)猝滅引起的，動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光給體的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生相互作用，這一過程遵從Stern-Volmer 方程(1)［2-3］:

KSV表示動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq表示雙分子猝滅過程的速率常數(shù)，τ0為猝滅劑不存在時熒光物質(zhì)的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命根據(jù)文獻(xiàn)報道［1］大約為10－8s。

圖3 熒光猝滅的Stern-Volmer 圖Fig.3 Fluorescent intensity quenching of Stern-Volmer plot

由圖3 可知，隨著H2TPP 濃度的變化，F(xiàn)0/F－1呈良好的線性關(guān)系，可以計算得Kq和KSV見表1。在動態(tài)猝滅過程中，一般情況下各類猝滅劑對生物分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù) Kq不大2 ×1010L/(mol·L)，然而這兩個溫度下的Kq都＞2×1010L/(mol·L)，則該猝滅不是因為H2TPP 對BSA 動態(tài)碰撞引起的動態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下H2TPP 與BSA 的猝滅常數(shù)Table 1 Quenching parameters of BSA withH2TPP at different temperatures

在靜態(tài)猝滅中，猝滅劑分子與蛋白質(zhì)靶分子形成配合物，其結(jié)合常數(shù)越大，則藥物分子的活性越高，得到了熒光強(qiáng)度F、猝滅劑濃度［Q］、結(jié)合平衡常數(shù)K0和結(jié)合數(shù)n 之間的關(guān)系［4-5］(2):

以lg［Q］為橫坐標(biāo)，lgF/(F0－F)坐標(biāo)作圖，見圖4。求得平衡常數(shù)K0，n，見表2。

說明BSA 分子與四苯基卟啉分子以1∶1 形式結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物隨溫度的升高，結(jié)合常數(shù)增大，符合靜態(tài)猝滅的規(guī)律，同時也反映了該結(jié)合作用活性較高。

2.2.2 結(jié)合作用 猝滅劑分子與生物分子之間的作用力通常包括氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水作用力等，或是幾種作用力的綜合表現(xiàn)。當(dāng)溫度變化不大時，結(jié)合反應(yīng)的焓變可看成一個常數(shù)，根據(jù)以下熱力學(xué)公式［6］:

計算得H2TPP 與BSA 相互作用的熱力學(xué)常數(shù)，見表3。

表3 BSA 與H2TPP 結(jié)合的熱力學(xué)函數(shù)Table 3 Thermodynamics parameters of BSA with H2TPP

根據(jù)過程是吉布斯生成自由能ΔG ＜0，該反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，說明反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而放出能量，熱力學(xué)焓變ΔH 和熵變ΔS 都＜0，H2TPP 與BSA 之間的作用力主要是范德華力和氫鍵，但其中的疏水作用也不能忽略。白蛋白的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，在它的研究過程中宏觀的表現(xiàn)通常是幾種作用力共同作用的結(jié)果，但容易受外界環(huán)境因素的影響。

2.2.3 同步熒光 利用同步熒光可以了解分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響［4］。通過選擇合適的波長差可將普通熒光光譜上相互重疊的熒光峰分開。蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是色氨酸和酪氨酸殘基所引起的，研究發(fā)現(xiàn)，同步熒光光譜Δλ=15 nm，Δλ=60 nm 分別顯示酪氨酸殘基，色氨酸殘基的光譜特性見圖4。

圖4 四苯基卟啉對BSA 的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BSA with H2TPP

由圖4 可知，當(dāng)△λ=60 nm 時熒光強(qiáng)度變化明顯，所以該結(jié)合作用可能是由于四苯基卟啉與色氨酸的結(jié)構(gòu)比較相似而結(jié)合，導(dǎo)致了熒光猝滅。

3 結(jié)論

主要通過紫外光譜研究了四苯基卟啉的紫外可見光譜性質(zhì)，H2TPP 有一個較強(qiáng)的Soret 帶和4 個Q帶，分別是a1u(π)-eg(π*)和a2u(π)-eg(π*)躍遷引起的。并通過熒光光譜研究了H2TPP 與BSA 相互作用，H2TPP 對BSA 的內(nèi)源熒光有猝滅作用，通過Stern-Volmer 方程等模型計算了該相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點，判定該過程為靜態(tài)猝滅。并通過熱力學(xué)常數(shù)的變化，說明該過程是自發(fā)進(jìn)行，主要推動力為氫鍵和范德華力，通過同步熒光光譜，判斷該結(jié)合位點主要在BSA 的色氨酸殘基位置。

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