石奇

(西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花［1］。古人將其列為上品，素有“久服輕身”的說(shuō)法，現(xiàn)代研究表明其具有抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、抑菌［4］等功效。綠原酸是植物細(xì)胞在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物合成的一種苯丙素類物質(zhì)［5］，綠原酸作為金銀花的主要活性成分之一［6-7］，曾引起學(xué)者的廣泛關(guān)注［8-9］。但目前提取過(guò)程主要存在提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取溫度較高，金銀花綠原酸活性降低等問(wèn)題。酶解法提取植物中有效成分具有快速、高效、反應(yīng)時(shí)間短、條件溫和等諸多優(yōu)點(diǎn)［10-11］。

羥基自由基(OH·)是一種能殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物的活性氧［12］。衰老的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為，超氧陰離子自由基(O2－·)是生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的高毒活性氧［13］。油脂過(guò)氧化值(POV)是油脂及其制品酸敗程度的標(biāo)志，POV值越大，說(shuō)明酸敗程度越高［14］。

本研究采用纖維素酶對(duì)金銀花綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以維C 為對(duì)照，評(píng)價(jià)其對(duì)OH·、O2－·以及油脂的抗氧化活性，以期為金銀花綠原酸在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

金銀花(產(chǎn)自河北省邢臺(tái)市);纖維素酶(酶活力≥400 U/mg);綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%);豬油;無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、硫代硫酸鈉、三氯甲烷、碘化鉀、鄰苯三酚、乙酸乙酯、雙氧水、無(wú)水碳酸鈉、冰乙酸均為分析純;乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純。

RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;LXJ-64-01 型離心機(jī);TV-180 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);FZ102 型粉碎機(jī);DF-101S 恒溫水浴鍋;AGILENTLC 12 型高效液相色譜儀。

1.2 金銀花綠原酸提取工藝

取100.00 g 金銀花干燥粉末，加入纖維素酶，在乙醇水溶液中定溫提取，離心分離，得金銀花濾渣。再次提取，合并2 次提取液，減壓濃縮，在冰浴中對(duì)液體進(jìn)行滅酶活處理，用乙酸乙酯純化處理［15］，低溫真空干燥，得金銀花綠原酸。

1.3 金銀花綠原酸含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定金銀花中綠原酸［16］。色譜柱為C18 粒(250 nm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈∶0.4%磷酸(15∶85)，超聲處理15 min，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，樣品在進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾。

精密稱取綠原酸對(duì)照品0.010 6 g，加50%甲醇溶解，并稀釋至50.0 mL，即為對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 置棕色量瓶中，加50% 甲醇稀釋至10.0 mL，搖勻，按上述色譜條件，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y =5.322 1x +0.581 9，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 6。

1.4 抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 羥基自由基OH·的清除能力測(cè)定 OH·體系的產(chǎn)生［17］，根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程略作修改。吸取0.75 mmol/L的鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液1.0 mL，依次加入pH=7.4 磷酸鹽緩沖液2 mL，0.75 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，蒸餾水2.0 mL，反應(yīng)液35 ℃水浴保溫1.5 h，參比溶液用蒸餾水代替FeSO4溶液，于536 nm 處測(cè)定吸光度A0。在上述條件下，蒸餾水減少1 mL，相應(yīng)加入1 mL 0.01% H2O2溶液，測(cè)定吸光度A1。

對(duì)OH·的清除能力進(jìn)行測(cè)定:按上述步驟，在加H2O2前，以配制好的不同濃度的綠原酸溶液或維C 溶液代替1.0 mL 蒸餾水，測(cè)定其吸光度Ax。

1.4.2 超氧陰離子自由基O2－·清除能力測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法［17］，根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程略作修改。分別吸取 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液2.5 mL，蒸餾 水3. 2 mL，在25 ℃水 浴 中保 溫20 min，取出加入25 ℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L 鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻后，在325 nm 下每隔5 min 測(cè)吸光度。參比溶液以0.01 mol/ L HCl 替代鄰苯三酚，計(jì)算吸光度隨時(shí)間的變化率C0。

對(duì)O2－·的清除能力進(jìn)行測(cè)定:依上所述，在加入鄰苯三酚前，加入配制好的不同濃度的綠原酸溶液或維C 溶液1.0 mL，蒸餾水相應(yīng)的減少1.0 mL，在波長(zhǎng)為325 nm 下間隔5 min 測(cè)其吸光度。計(jì)算吸光度隨時(shí)間的變化率Cx。

1.4.3 綠原酸對(duì)豬油的抗氧化能力測(cè)定

1.4.3.1 供試樣品的制備 稱取金銀花綠原酸24 mg，溶于1 mL 乙醇中，加入20 g 豬油中，充分?jǐn)嚢枞芙?，配成含氧化?.2 mg/g 的母液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)再配制出不同濃度的待測(cè)液。

1.4.3.2 油脂過(guò)氧化值測(cè)定過(guò)程［18］稱取2.00 ～3.00 g 混勻的試樣，加30 mL 三氯甲烷-冰乙酸混合液。加入飽和碘化鉀溶液1.00 mL，振搖后避光放置3 min。加100 mL 水，搖勻，用0. 01 mol/L NaS2O3標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)，消耗NaS2O3溶液體積為V1，空白實(shí)驗(yàn)消耗NaS2O3溶液體積為V0。

式中，c 為NaS2O3溶液的物質(zhì)的量濃度;m 為用于測(cè)定所取油樣質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解提取工藝優(yōu)化

根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)提取溫度、酶用量、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4 個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化，以金銀花綠原酸提取率為考察指標(biāo)，因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

由表2 可知，4 個(gè)因素對(duì)提取效果的影響程度大小為酶用量﹥提取時(shí)間﹥提取溫度﹥乙醇體積分?jǐn)?shù)，確定最佳的工藝條件為:A2B2C1D2，即酶用量0.6%，提取時(shí)間60 min，提取溫度55 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。在該最佳工藝條件下，重復(fù)3 次平行實(shí)驗(yàn)，得金銀花綠原酸平均提取率為4.85%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 HPLC 色譜檢測(cè)分析

將金銀花綠原酸樣品研成細(xì)粉，稱取細(xì)粉約0.5 g，加入50% 甲醇50 mL，超聲處理15 min，過(guò)濾。吸取濾液5 mL，加50% 甲醇至25 mL，即為提取樣品溶液。綠原酸對(duì)照品與提取樣品溶液各20 μL分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1 和圖2。

圖1 綠原酸對(duì)照品HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard chlorogenic acid

圖2 金銀花綠原酸HPLC 圖Fig.2 HPLC chromatogram of chlorogenic acid from Lonicera Japonica

綠原對(duì)照品在圖1 中的出峰時(shí)間為3.13 min，圖2 中在3.13 min 也出現(xiàn)綠原酸最大吸收峰出峰，由此可以推斷，提取產(chǎn)品主要成分為綠原酸。

2.3 羥基自由基OH·的清除能力

金銀花綠原酸與維C 對(duì)OH·清除的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 金銀花綠原酸與維C 對(duì)OH·的清除率Fig.3 Effects of chlorogenic acid from Flos Lonicerae and VC on the OH· scavenging rate

由圖3 可知，在0.2 ～0.5 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，金銀花綠原酸顯示出一定的抗氧化性，且隨著質(zhì)量濃度的升高，它對(duì)OH·的清除能力增強(qiáng)，其最大清除率為61.26%。而同樣質(zhì)量濃度下，維C 的最大清除率為56.23%。

為了更好的說(shuō)明測(cè)試樣品的抗氧化性，對(duì)圖3中清除率曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸，OH·清除率與不同待測(cè)物濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，回歸方程分別為y =18.20 lnx +74.62(金銀花綠原酸)，R2=0.994 0;y=12.65 lnx+ 65.80(維C)，R2=0.996 0。

以O(shè)H·被消耗掉50%所需抗氧化劑的用量(半抑制量IC50)來(lái)表征，在清除OH·體系中，金銀花綠 原 酸IC50為0. 258 6 mg/mL，維C IC50為0.286 8 mg/mL。IC50越小，清除自由基的能力越強(qiáng)，因此，對(duì)OH·清除效果金銀花綠原酸比維C略好。

2.4 超氧陰離子自由基O2－·的清除能力

金銀花綠原酸與維C 對(duì)O2－·清除的結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 金銀花綠原酸與維C 對(duì)2·的清除率Fig.4 Effects of chlorogenic acid from Flos Lonicerae and VC on the O2－· scavenging rate

由圖4 可知，在0.1 ～0.4 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，顯示出金銀花綠原酸具有很強(qiáng)的清除O2－·的能力，且隨著質(zhì)量濃度的升高，清除效果更好，其最大清除率為94.81%，而同樣質(zhì)量濃度下，維C 的最大清除率為74.25%。

對(duì)圖4 中清除率曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸，回歸方程分別為y=40.23 lnx+132.5(金銀花綠原酸)，R2=0.994 0;y=115.6 x+29.67(維C)，R2=0.989 0。

在清除O2－·體系中，金銀花綠原酸IC50為0.128 6 mg/mL，維C IC50為0.175 9 mg/mL，因此金銀花綠原酸對(duì)O2－·清除效果較好。

2.5 豬油抗氧化能力

將配好的7 份試樣放入恒溫箱65 ℃，每隔2 d，取樣測(cè)定豬油的過(guò)氧化值，觀測(cè)期為18 d。金銀花綠原酸及VC 對(duì)豬油的抗氧化能力見(jiàn)圖5。

圖5 油脂過(guò)氧化值隨時(shí)間變化Fig.5 The changes of POV value

由圖5 可知，在豬油中添加不同濃度提取物金銀花綠原酸和維C 后，所有測(cè)試組的POV 值都明顯低于空白油脂的值，說(shuō)明提取物金銀花綠原酸和維C 對(duì)豬油都具有較好的抗氧化能力。當(dāng)金銀花綠原酸添加量為360 mg/kg 時(shí)，抗油脂氧化能力最好;維C 在添加量為360 mg/kg 時(shí)，在實(shí)驗(yàn)系列濃度內(nèi)，也有相同的趨勢(shì)表現(xiàn)。因此可以推斷，測(cè)試樣品的抗氧化能力是隨其添加量的增加而增強(qiáng)的。金銀花綠原酸有更出色的表現(xiàn)，將POV 值在觀測(cè)期內(nèi)維持在5.5 mol/g 以下。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了纖維素酶解法提取金銀花綠原酸的工藝條件，最佳酶解工藝條件為:提取溫度55 ℃，酶用量(對(duì)底物濃度)0.6%，提取時(shí)間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。此條件下，金銀花綠原酸平均提取率為4.85%。該研究工藝具有提取條件溫和、操作時(shí)間短，能夠極大的保證提取產(chǎn)品活性的特點(diǎn)。

(2)在體外抗氧化活性的研究中，金銀花綠原酸抗氧化能力與綠原酸濃度在一定范圍內(nèi)成劑量關(guān)系。金銀花綠原酸添加量0.5 mg/mL 時(shí)，對(duì)OH·的清除率達(dá)61.26%，IC50為0.258 6 mg/mL，比維C效果略好。添加量0.4 mg/mL 時(shí)，對(duì)O2－·的清除率高達(dá)94.81%，IC50為0.128 6 mg/mL，清除效果明顯優(yōu)于維C。金銀花綠原酸在恒溫65 ℃下，將POV值在18 d 內(nèi)維持在5.5 mol/g 以下，金銀花綠原酸具較強(qiáng)的清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。

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