文/楊 景 劉松玲 葛紹陽(yáng) 劉 力 桑 躍 武永超 張建銘 劉治麟 趙 亮,*

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京市高等學(xué)校畜產(chǎn)品工程研究中心；2江西鴻燕健康科技有限公司；3北京和益源生物技術(shù)有限公司）

CD4+T細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)中有重要作用，初始CD4+T細(xì)胞（Na?ve CD4+T）在機(jī)體內(nèi)不同細(xì)胞因子的作用下，分化為一系列具有不同功能的細(xì)胞群。樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells，DCs）是目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中有重要功能。CD103+DCs，作為一種重要的調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（regDCs），可通過(guò)分泌視黃酸和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子，促進(jìn)na?ve CD4+T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T（Foxp3+Treg）細(xì)胞分化，在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的Th1/Th2免疫失衡和維持機(jī)體免疫自穩(wěn)中起重要作用[1]。

益生菌可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡和腸黏膜免疫系統(tǒng)。研究表明，益生菌可以通過(guò)提高小鼠淋巴細(xì)胞中Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量，調(diào)節(jié)小鼠炎癥反應(yīng)中的T細(xì)胞平衡[2]，而這種調(diào)節(jié)作用與其誘導(dǎo)DCs成熟、分化有關(guān)。已有研究表明，益生菌可以與DCs表面Toll樣受體或C型凝集素受體等結(jié)合，誘導(dǎo)DCs成熟及細(xì)胞因子的分泌[3]，進(jìn)而增加機(jī)體內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量，緩解風(fēng)濕、腸炎和過(guò)敏性哮喘等免疫失衡性疾病癥狀[4，5]。

副干酪乳桿菌L9分離自健康人腸道。課題組前期研究表明，L9具有調(diào)節(jié)小鼠腸道免疫功能的生物學(xué)活性[6]。然而，L9是否通過(guò)調(diào)節(jié)DCs功能，促進(jìn)CD4+T分化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)生物學(xué)活性尚不清楚。因此，本研究以骨髓源樹突狀細(xì)胞（BMDCs）為模型，研究L9對(duì)其細(xì)胞因子的分泌及CD103表達(dá)的影響，利用L9誘導(dǎo)后的BMDCs與小鼠脾CD4+T細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，分析Foxp3+Treg細(xì)胞比例。

1 材料與方法

1.1 菌株

副干酪乳桿菌L 9（曾用名L14）由教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將實(shí)驗(yàn)菌株L9接種至MRS培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定期（12 h），將菌液4 500 r/min離心10 min后，用滅菌的0.01 mol/L、pH值7.4 PBS緩沖液重懸，調(diào)整菌液濃度為1.0×1010CFU/mL，100 ℃水浴30 min，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)活菌存在，且菌株保持正常形態(tài)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究動(dòng)物為SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，6 周齡。飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院動(dòng)物房，環(huán)境溫度24 ℃，濕度40%～60%，光照12 h，試驗(yàn)前靜養(yǎng)1 周左右。

1.3 試劑

淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司產(chǎn)品；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒為R&D公司產(chǎn)品；RPM1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；絲裂酶素C購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白細(xì)胞介素4（rmIL-4）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；流式抗體購(gòu)自美國(guó)ebioscience公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 骨髓源樹突細(xì)胞分離與培養(yǎng)

提取小鼠骨髓細(xì)胞，添加rmGM-CSF、rmIL-4誘導(dǎo)6 天后，收集細(xì)胞為BMDCs。調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×106CFU/mL，接種于6 孔板中。設(shè)置空白組（CON），陽(yáng)性對(duì)照組（LPS，1 μg/mL；Pam3C，1 μg/mL）和2 個(gè)試驗(yàn)組（L9菌懸液，一組濃度為1.0×106CFU/mL，一組為1.0×107CFU/mL）。每孔總體積為3 mL，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。連續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞懸液離心，收集上清液用于細(xì)胞因子檢測(cè)，收集細(xì)胞用于流式分析及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 樹突狀細(xì)胞與小鼠脾CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)

收集各組BMDCs，經(jīng)絲裂霉素C滅活處理30 min，然后與小鼠脾淋巴細(xì)胞分離的CD4+T細(xì)胞（2.0×106CFU/mL）共培養(yǎng)（BMDCs︰CD4+T cell=1︰10），60 h后收集細(xì)胞，用于流式分析。

1.4.3 樹突狀細(xì)胞中CD103表達(dá)及CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例檢測(cè)

收集各組BMDCs，添加單抗標(biāo)記CD11c（FITC）、CD103（PE）和MHCII（PerCP-eFluor710），4 ℃下避光30 min，PBS緩沖液清洗，然后細(xì)胞懸浮于PBS緩沖液中，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD103表達(dá)情況。

收集與樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)后的小鼠脾CD4+T細(xì)胞，添加單抗標(biāo)記CD4（FITC），CD25（PE）和Foxp3（APC），通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面抗原分子的表達(dá)情況，分析CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞比例。

1.4.4 細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平檢測(cè)

測(cè)定BMDCs細(xì)胞上清液中TGF-β和IL-10濃度，按照各ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS12.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），Duncan’s multiple-comparison test分析組間差異，以P<0.05為顯著性，各組數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 L9 調(diào)節(jié)骨髓源樹突狀細(xì)胞因子分泌

樹突狀細(xì)胞可分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。由圖1可以看出，與空白對(duì)照組相比，L9能夠顯著促進(jìn)BMDCs分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，且有劑量效應(yīng)。高劑量L9促進(jìn)TGF-β分泌增加了3.03 倍，高于陽(yáng)性對(duì)照組；同時(shí)促進(jìn)IL-10分泌增加了26.58 倍。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，DCs不僅是體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，而且對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在自身免疫性疾病中，分泌高水平調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β）的調(diào)節(jié)性DCs能夠促進(jìn)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的生成，抑制多種炎性細(xì)胞因子的分泌，從而維持機(jī)體免疫耐受[1]。益生菌具有調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的功能，能夠維持機(jī)體免疫系統(tǒng)健康和穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以與DCs表面受體結(jié)合（如Toll樣受體，C型凝集素受體等），誘導(dǎo)DCs功能，但存在菌株差異性[3，7]；益生菌可以提高小鼠腸系膜淋巴結(jié)的調(diào)節(jié)性DCs中IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞增多，緩解小鼠腸道炎癥[4]；長(zhǎng)雙歧桿菌可以調(diào)節(jié)BMDCs成熟狀態(tài)，促進(jìn)IL-10和TGF-β分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)Treg細(xì)胞增多，緩解小鼠花粉過(guò)敏反應(yīng)[5]。

圖1 L9 對(duì)骨髓源樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

本研究結(jié)果表明，L9可以促進(jìn)BMDCs分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，具有調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞向Foxp3+Treg細(xì)胞分化的潛能。

2.2 L9 調(diào)節(jié)骨髓源樹突狀細(xì)胞 中CD103表達(dá)

圖2 L9對(duì)骨髓源樹突狀細(xì)胞中CD103表達(dá)的影響

CD103+DCs是參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的一類重要的調(diào)節(jié)性DCs，可分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生[1]。本研究中，采用流式細(xì)胞術(shù)分析了樹突狀細(xì)胞中CD103的表達(dá)，如圖2所示，與空白組相比，L9能夠顯著促進(jìn)BMDCs中CD103的表達(dá)，且高劑量L9組中CD103表達(dá)的升高幅度達(dá)87.06%，高于陽(yáng)性對(duì)照組。

機(jī)體內(nèi)的DCs有許多不同亞型，其中CD103+DCs是一種重要的調(diào)節(jié)性DCs，參與調(diào)節(jié)許多炎癥反應(yīng)。腸黏膜層的CD103+DCs可以通過(guò)TGF-β和視黃酸代謝途徑促進(jìn)naive CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化[2]。有研究表明，食物過(guò)敏小鼠的腸組織淋巴細(xì)胞中CD103+DCs細(xì)胞比例降低[8]，證實(shí)了CD103+DCs在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受方面的重要性。益生菌與CD103+DCs相關(guān)研究表明，用雙歧桿菌灌胃小鼠，可提高小鼠腸道中CD103+DCs分泌IL-10水平，促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，緩解小鼠腸道炎癥反應(yīng)[9]。相似實(shí)驗(yàn)表明，益生菌雖然可以促進(jìn)DCs中IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)，但CD103+DCs細(xì)胞比例并沒有顯著變化[4]。

在本研究中，L9不但促進(jìn)了BMDCs中IL-10和TGF-β的分泌，還促進(jìn)了CD103的表達(dá)，表明L9可以通過(guò)提高CD103+DCs細(xì)胞數(shù)量來(lái)參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡。

2.3 L9 調(diào)節(jié)CD4+T 細(xì)胞向Foxp3+Treg 細(xì)胞分化

調(diào)節(jié)性DCs可以促進(jìn)機(jī)體內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞分化，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。為了更全面地研究L9對(duì)DCs功能的促進(jìn)作用，采用L9誘導(dǎo)后的BMDCs與小鼠CD4+T 細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，使用流式細(xì)胞術(shù)分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例。由圖3可以看出，與空白組相比，L9組小鼠CD4+淋巴細(xì)胞中CD25＋－Foxp3+Treg細(xì)胞比例顯著增加，且以高劑量L9組增加幅度最大。結(jié)果表明，L9刺激后的BMDCs能夠促進(jìn)過(guò)敏小鼠CD4+T 細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)，可以調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞平衡。

圖3 L9 對(duì)小鼠CD4+T 細(xì)胞中CD25+ Foxp3+Treg 細(xì)胞數(shù)量的影響

Foxp3+Treg細(xì)胞可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞平衡，在建立機(jī)體免疫耐受及緩解炎癥反應(yīng)中起到關(guān)鍵性作用。研究表明，益生菌可以提高小鼠體內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量，緩解炎癥反應(yīng)[4,10]。機(jī)體內(nèi)na?ve CD4+T細(xì)胞向Foxp3+Treg細(xì)胞分化與CD103+DCs功能有關(guān)[2]。本研究結(jié)果表明，L9誘導(dǎo)的BMDCs提高CD4+T中Foxp3+Treg細(xì)胞比例，證明L9可以通過(guò)誘導(dǎo)DCs功能，參與Foxp3+Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

以骨髓源樹突狀細(xì)胞（BMDCs）為模型，研究了L9對(duì)DCs功能的影響。研究表明，L9促進(jìn)BMDCs分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β），提高CD103表達(dá)，可以誘導(dǎo)Foxp3+Treg細(xì)胞分化。由此可見，L9可以通過(guò)調(diào)節(jié)DCs分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)機(jī)體偏向Foxp3+Treg型細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果揭示，L9的免疫調(diào)節(jié)活性與其提高CD103表達(dá)有關(guān)，但其分子免疫學(xué)機(jī)制還不是很清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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