韓雪蕾，喬瑞敏，李素雅，耿寧權(quán)，呂 剛，李改英，李 明，任廣志，李新建

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省新大牧業(yè)有限公司，鄭州 45000)

MC4R基因遺傳變異與豬生長性狀的相關(guān)性分析

韓雪蕾1，喬瑞敏1，李素雅2，耿寧權(quán)1，呂 剛1，李改英1，李 明1，任廣志1，李新建1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省新大牧業(yè)有限公司，鄭州 45000)

為了揭示豬生長性狀分子輔助選擇標(biāo)記在不同群體中的遺傳效應(yīng)，本研究采用PCR-RFLP技術(shù)，在杜洛克豬、大白豬、長白豬和豫南黑豬群體中對生長性狀相關(guān)候選基因MC4R的遺傳多樣性進行檢測，并分析其與豬平均日增重、平均日采食量和料重比的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示：MC4R 的D298N 變異位點在4個豬群中均存在多態(tài)性，其中G等位基因為優(yōu)勢等位基因；性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，在杜洛克豬群體中，GG基因型個體的平均日增重顯著高于AA基因型 (P＜0.05)、料重比顯著低于AA基因型 (P＜0.05)；在長白豬群體和大白豬群體中GG基因型個體的平均日增重具有高于AA、AG基因型的趨勢，料重比有低于AA、AG基因型，但均未達到顯著水平(P＞0.05)。

豬；生長性能；料重比；MC4R基因；關(guān)聯(lián)分析

MC4R基因在動物體重、采食量和能量穩(wěn)態(tài)的控制中具有重要作用，在人、豬和馬等哺乳動物中研究發(fā)現(xiàn)其主要影響機體脂肪、增重、采食等性狀[1]。據(jù)報道在MC4R基因敲除的小鼠中有大量的脂肪囤積，表現(xiàn)出惡性肥胖，研究表明MC4R基因與肥胖有關(guān)。在不同物種中研究發(fā)現(xiàn)，MC4R 基因在體重、能量穩(wěn)態(tài)和采食量的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。Kim等發(fā)現(xiàn)在豬MC4R基因中存在一個錯義突變D298N，改變了該受體TM7中天冬酰胺的高度保守性，且該多態(tài)與采食量、背膘厚、達100 kg體重日齡和生長率存在顯著相關(guān)性[2-6]。Qiu等研究發(fā)現(xiàn)在雞MC4R基因的5′UTR和CDS中存在4個SNP位點，進一步研究確定4個多態(tài)位點與體質(zhì)量、生長和胴體性狀之間存在關(guān)聯(lián)性[7]。

鑒別經(jīng)濟動物重要性狀主效基因是極具挑戰(zhàn)性的工作，陸續(xù)有相關(guān)報道， 如IGF2[8]、pRKAG3[9]、RYR1[10]和Pit-1[11]等基因被認(rèn)為是豬重要經(jīng)濟性狀的主效基因，在動物遺傳育種工作中具有重大的研究價值。本研究為了進一步揭示MC4R基因在不同種豬群體的遺傳變異及其與生長性狀間的關(guān)系，選取杜洛克豬、長白豬和大白豬和豫南黑豬4個品種，檢測MC4R基因的第7跨膜結(jié)構(gòu)功能域的一個高度保守區(qū)內(nèi)的一個G/A突變（D298N）的多態(tài)性，并進行了與生長性狀之間的關(guān)聯(lián)分析，為分子標(biāo)記在生長性狀選育過程中的應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

表1 引物信息

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物包括167頭新美系大白豬、71頭新美系長白豬、70頭新美系杜洛克豬以及375頭豫南黑豬。采取試驗豬的耳組織樣，用耳號鉗在豬耳朵下緣的耳缺內(nèi)，剪下一塊豬耳組織，并置于裝有75%乙醇的Eppendorf管中，采用酚氯仿法提取DNA，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 性能測定

所有試驗豬在測定過程中，體重30 kg左右開始測定，于120 kg左右結(jié)束，體重、日 食量由奧斯本自動飼喂系統(tǒng)進行統(tǒng)計和記錄，計算平均日采食量、平均日增重及料重比。

1.3 MC4R基因的PCR-RFLP 檢測

1.3.1 引物的設(shè)計及PCR擴增

PCR引物合成參考Kim[6]的研究結(jié)果，引物序列以及PCR擴增產(chǎn)物的大小見表1，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系如表2所示。PCR反應(yīng)程序：根據(jù)設(shè)計的引物對和模板，選用最佳的退火溫度，并且根據(jù)擴增片段大小的不同，對30個循環(huán)中退火及延伸的時間稍做變動，一般在擴增500 bp以下的片段時，時間控制在30～60 s，本試驗PCR擴增程序如表3所示。

1.3.2 PCR產(chǎn)物酶切和檢測

限制性內(nèi)切酶混合液體系如表4所示，在37 ℃溫度下酶切15 min，配置濃度為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR擴增程序

表4 限制性酶切體系

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

用EXCEL2007對不同品種豬的平均日采食量、平均日增重和料重比進行統(tǒng)計分析；用Popgene1.32軟件計算基因頻率、基因型頻率，用SPSS20.0進行基因與性狀間相關(guān)性分析和方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC4R基因 D298N 主效位點的PCR產(chǎn)物檢測及測序

以杜洛克豬、大白豬、長白豬和豫南黑豬基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到的擴增片段產(chǎn)物，片段清晰，大小一致(226 bp)，回收PCR產(chǎn)物，測序，測得序列與NCBI公布的MC4R基因序列一致，并且含有TaqI內(nèi)切酶酶切位點；TaqI內(nèi)切酶能識別TCGA/ AGCT位點，可以進行后續(xù)的酶切反應(yīng)（如圖1、圖2）。

2.2MC4R基因 D298N 主效位點的酶切檢測及結(jié)果分析

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳圖

圖2 PCR產(chǎn)物測序峰圖

圖3 酶切產(chǎn)物的電泳圖

經(jīng)TaqI限制性內(nèi)切酶酶切，酶切后產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳（如圖3）。酶切產(chǎn)物為156和70 bp 2條帶，298位編碼天冬氨酸(GAU)，該基因型定義為AA；酶切產(chǎn)物同時出現(xiàn)226bp、156bp和70 bp 3條帶，定義為AG型；當(dāng)突變G-A發(fā)生后，298位編碼天冬酰胺(AAU)，TaqI酶切位點消失，酶切產(chǎn)物只有226 bp 1條帶，定義為GG型。

2.3MC4R基因D298N 主效位點在不同豬群體中基因型頻率和基因頻率

利用PCR-RFLP技術(shù)對杜洛克豬、大白豬、長白豬和豫南黑豬群體進行MC4R基因型檢測，不同群體豬MC4R基因 D298N 主效位點的基因型頻率和基因頻率見表5。在杜洛克群體中，AG型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.44，AA型和GG型的基因型頻率分別為0.26、0.30，等位基因A基因頻率為0.48，等位基因G基因頻率為0.52。在大白豬群體中， AA型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.71，AG型和GG型的基因型頻率分別為0.25和0.04；G和A的等位基因頻率分別為0.16和0.84。在長白豬群體中，優(yōu)勢基因型為AA型，基因型頻率為0.59，AG型和GG型的基因型頻率分別是0.34和0.07，G和A的等位基因頻率分別為0.24和0.76。在豫南黑豬群體中，優(yōu)勢基因型為AG型，基因型頻率為0.49，AA型和GG型的基因型頻率分別是0.23和0.28；G和A的等位基因頻率分別為0.48和0.52。

2.4MC4R基因D298N主效位點不同基因型與不同品種豬生長性狀間的相關(guān)性分析

在杜洛克豬、大白豬和長白豬群體中，對MC4R基因不同基因型與平均日采食量、平均日增重、料重比進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表6。結(jié)果顯示：在杜洛克豬群體中，GG型個體的平均日采食量高于其他2種基因型，但差異不顯著(P=0.271)；GG型個體的日增重最高，且顯著高于AA型個體(P=0.045)，與AG型個體間差異不顯著，且AG型與AA型個體間差異不顯著；GG型個體的料重比最低，極顯著高于AA型個體(P=0.001)，其他基因型間差異不顯著（P＞0.05）。在長白豬群體中，3種基因型個體間的平均日采食量、平均日增重和料重比差異均不顯著(P＞0.05)；其中GG型個體平均日增重最高，并且料重比最低。在大白豬群體中，3種基因型個體的平均日采食量、平均日增重和料重比差異均不顯著(P＞0.05)；其中GG型個體平均日增重最高，并且料重比最低。結(jié)果表明，在杜洛克豬群體中，GG型個體的生長速度最快；在長白豬和大白豬群體中，GG型個體比其他2種基因型個體的生長速度快。

表5 MC4R基因在4個中外豬種的基因頻率和基因型頻率

表6 MC4R不同基因型對不同品種不同生長性狀的影響

3 討論

3.1 豬MC4R基因在不同種群中的多態(tài)性分布

國內(nèi)外有眾多的專家學(xué)者對MC4R基因進行研究：劉桂蘭[12]采用PCRRFLP技術(shù)分析了MC4R基因部分片段在豬資源家系群體中的TaqI酶切片段多態(tài)性分布，MC4R基因在大白豬群體內(nèi)存在3種基因型，GG基因型頻率最低，優(yōu)勢等位基因為A等位基因；肖石軍等人對MC4R基因主效位點在大白豬群體中AA基因型頻率最高，A等位基因為優(yōu)勢等位基因；在杜洛克豬群體中，G等位基因為優(yōu)勢等位基因，這些研究結(jié)果與本試驗的研究結(jié)果一致；而在長白豬群體中，GG基因型頻率最高，G等位基因為優(yōu)勢等位基因，這與本試驗的結(jié)果不一致，原因可能是采集的樣本品系不同，存在遺傳背景差異的結(jié)果[13]。本試驗通過在豫南黑豬群體中檢測MC4R基因的多態(tài)性，結(jié)果顯示：等位基因頻率的分布與杜洛克豬相一致，G等位基因為優(yōu)勢等位基因，這與豫南黑豬在育種過程中導(dǎo)入62.5%的杜洛克豬血統(tǒng)有關(guān)。

3.2 豬MC4R基因與豬生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

MC4R在動物體重、采食量和能量穩(wěn)態(tài)的控制中具有重要作用，另外有學(xué)者報道MC4R發(fā)生突變對動物的生長、脂肪性狀產(chǎn)生較大的影響。肖石軍等人對MC4R基因與生長肥育性狀的關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，相對于AA型個體，GG型個體生長速度更快[9]。本試驗結(jié)果顯示在杜洛克豬群體中，GG型個體的日增重和料重比都是顯著高于AA型個體(P＜0.05)，GG型個體的生長速度顯著高于另外2種。在長白豬群體和大白豬群體中，3種基因型個體的日采食量、日增重和料重比差異都不顯著(P＞0.05)；但是其中GG型個體日增重最高，并且料重比最低，所以，在長白豬和大白豬群體中，GG型個體都是比其他2種基因型個體的生長速度快。

在功能基因的關(guān)聯(lián)性研究中，不同學(xué)者經(jīng)常出現(xiàn)不相同的研究結(jié)果，其主要原因是不同試驗群體具有不同的遺傳背景，使得真正的主效基因與目的標(biāo)記連鎖不平衡程度各不相同，因而，目的標(biāo)記對所研究性狀產(chǎn)生的影響效應(yīng)也不一樣。在許多商業(yè)種豬群中，MC4R 基因D298N主效位點并未純合，這就為種豬的遺傳改良提供了可能。由于MC4R基因D298N主效位點GG型個體豬生長更快，而AA型個體生長更慢，可根據(jù)其不同的生產(chǎn)和銷售目標(biāo)，選擇不同的基因型個體進入核心群，繁育改良核心種豬群的生產(chǎn)性狀。

4 小結(jié)

豬MC4R基因D298N 主效位點在不同品種群體的基因型頻率和基因頻率存在差異，本試驗進一步驗證了MC4R基因多態(tài)性對豬生長性狀的影響效應(yīng)，為MC4R基因作為豬分子遺傳標(biāo)記提供一定的依據(jù)，同時為利用分子標(biāo)記選育優(yōu)良的品種提供一定的參考價值。

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2015-10-13)

河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊（S2012-06）；國家自然科學(xué)基金（U1304325）；鄭州科技創(chuàng)新團隊（141PCXTD513）。

韓雪蕾（1982-），女，河南周口人，博士，hxl014@126.com

*通訊作者：李新建（1977-），男，河南鄲城人，博士，副教授，E-mail:lxjlongfei@163.com