續(xù) 嶺 謝明祥 唐懷波 張 平 張 永 石貴新 劉勝遠(yuǎn)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 遵義 563003

瘤內(nèi)注射樹突狀細(xì)胞對(duì)C6膠質(zhì)瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

續(xù) 嶺 謝明祥△唐懷波 張 平 張 永 石貴新 劉勝遠(yuǎn)
遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 遵義 563003

目的 通過構(gòu)建SD大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，成瘤后瘤內(nèi)注射樹突狀細(xì)胞，探討樹突狀細(xì)胞對(duì)C6膠質(zhì)瘤的抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。方法 30只SD大鼠腦內(nèi)注射C6細(xì)胞，成瘤后隨機(jī)分3組。A組：沿原注射部位瘤內(nèi)注入10μL培養(yǎng)液。B組：同法注入10μL含106個(gè)未成熟DC的培養(yǎng)液。C組：同法注入10μL含106個(gè)成熟DC的培養(yǎng)液。分析3組大鼠的生存時(shí)間；取不同組大鼠的腦內(nèi)腫瘤，制作冰凍病理切片，染色后鏡下觀察；腫瘤組織制成細(xì)胞懸液后細(xì)胞爬片，免疫組化檢測(cè)Fas在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，計(jì)算積分光密度值。結(jié)果 （1）生存時(shí)間：C組載瘤大鼠生存時(shí)間長于A、B2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）腫瘤病理結(jié)果：C組腫瘤組織大片壞死區(qū)，B組小片壞死區(qū)，A組無明顯壞死區(qū)。（3）免疫組化：Fas表達(dá)，細(xì)胞積分光密度值（IOD），C組明顯高于A、B組。結(jié)論 成熟DC可誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，途徑之一可能是增強(qiáng)抗原提呈，提高細(xì)胞Fas的表達(dá)。

膠質(zhì)瘤；樹突狀細(xì)胞；抑制；Fas

膠質(zhì)瘤浸潤性生長，手術(shù)無法完全切除，放化療的不敏感性，使膠質(zhì)瘤病人預(yù)后較差，樹突狀細(xì)胞占主要地位的免疫治療方法值得探索，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 C6細(xì)胞株，SD大鼠（200g左右雄性），大鼠DC表型流式試劑盒，脂多糖（LPS），集落刺激因子、白介素-4，免疫組化Fas試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建腫瘤模型：腹腔注射水合氯醛后的大鼠固定于定位儀。切皮，取矢狀縫右旁3mm，冠狀縫前1mm交點(diǎn)鉆孔，進(jìn)針5mm，注射含106個(gè)C6細(xì)胞的培養(yǎng)液10μL。建模過程死亡1只。

1.2.2 樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)：脊椎脫臼處死大鼠，緩沖液沖洗股骨骨髓腔。獲得的沖洗液加入紅細(xì)胞裂解液，加入集落刺激因子、白介素-4，隔日半量換液。培養(yǎng)6d后DC流式細(xì)胞：DC表面特異性標(biāo)記OX62表達(dá)＞70％。培養(yǎng)8d經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)48h后DC表面分子標(biāo)記物MHC-II和CD80、CD86高表達(dá)，且高于未經(jīng)LPS誘導(dǎo)的DC，符合成熟DC特點(diǎn)。

1.2.3 鼠腦影像學(xué)表現(xiàn)：注射C6細(xì)胞后12d，27只大鼠在接種部位（尾狀核）T2顯示腫瘤樣高信號(hào)，2只未見異常信號(hào)。27只MRI異常大鼠隨機(jī)抽取1只取腦見尾狀核部位有異常組織，病理提示為膠質(zhì)瘤（見圖4）。

1.2.4 樹突狀細(xì)胞注射干預(yù)：建模12d，載瘤大鼠（26只隨機(jī)分3組）沿原注部位，注射10μL約含106個(gè)未成熟DC的培養(yǎng)液。同法C組注射10μL約106個(gè)成熟DC，A組注射10μL培養(yǎng)液，迷觀大鼠精神及運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。

1.2.5 病理檢查：載瘤大鼠死亡后取腦腫瘤，腫瘤經(jīng)固定、包埋、冰凍切片、染色、中性樹脂封固，200倍光鏡下觀察拍照。

1.2.6 細(xì)胞爬片及免疫組化：腫瘤組織碎裂成10×105/mL細(xì)胞懸液，接種爬片，固定，加入一抗、二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，封片，測(cè)量細(xì)胞積分光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)6dOX62表達(dá)水平

圖2 培養(yǎng)8d未經(jīng)LPS誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞分子標(biāo)記物表達(dá)水平

圖3 培養(yǎng)8dLPS誘導(dǎo)后樹突狀細(xì)胞分子標(biāo)記物表達(dá)水平

圖4 鼠腦MRI表現(xiàn)

圖5 大鼠腦腫瘤

圖6 HE×200倍鏡下觀察

2 結(jié)果

2.1 生存時(shí)間 26只載瘤大鼠隨機(jī)分組：A組9只大鼠，存活時(shí)間（19.89±1.69）d；B組8只，存活時(shí)間（21.13±1.81）d；C組9只，存活時(shí)間（25.11±1.76）d；C組與A、B組分別比較，生存時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組和B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。26只載瘤大鼠死亡后取腦，均見腫瘤。形態(tài)表現(xiàn)：腦中線移位，腫瘤尚邊界（圖5）。

2.2 病理結(jié)果 見圖6。

2.3 免疫組化腫瘤細(xì)胞Fas的表達(dá) Fas表達(dá)部位主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，表達(dá)強(qiáng)度C組＞B組＞A組。見表2，圖7。

圖7 腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)

表2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞IOD值比較 （±s）

表2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞IOD值比較 （±s）

注：Fas半定量檢測(cè)：3組積分光密度值比較，P＜0.05

組別 IOD值A(chǔ)組133 6.901 7±156.973 0 B組 164 5.502 6±276.282 6 C組244 4.151 2±331.907 8

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最多發(fā)的腫瘤，因其浸潤性的生長方式（尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤），導(dǎo)致其無法根除。腦內(nèi)無完整的淋巴系統(tǒng)，加之血腦屏障的存在，一些免疫大分子無法通過BBB（血腦屏障），這些使得腦免疫監(jiān)管功能低下［1］，免疫系統(tǒng)無法有效鑒別、排除異體成分。膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、VEGF等可使樹突狀表面的分子表達(dá)發(fā)生變化的有害因子，其中包括MHC-Ⅱ類分子表達(dá)調(diào)低［2-3］。膠質(zhì)瘤局部免疫環(huán)境使Fas表達(dá)下降，膠質(zhì)瘤無法完成該路徑凋亡。另外，缺乏IL-12、IFN-γ、穿孔素的鼠易長腫瘤，提示在腫瘤的免疫微環(huán)境下機(jī)體不能有效的啟動(dòng)免疫反應(yīng)［4-8］。

樹突狀細(xì)胞未成熟與成熟時(shí)期具有不同的功能，未成熟樹突狀細(xì)胞有很強(qiáng)的抗原辨別、吞噬能力，成熟樹突狀細(xì)胞抗原提呈能力強(qiáng)。樹突狀細(xì)胞不直接殺傷異病質(zhì)，通過識(shí)別、提呈抗原，激活CD4+Th和CD8+CTL細(xì)胞反應(yīng)［9］起作用。瘤內(nèi)注射樹突狀細(xì)胞后腦組織中DC含量增加，對(duì)膠質(zhì)瘤的殺傷作用，可能是樹突狀細(xì)胞促使機(jī)體表達(dá)共刺激分子、黏附分子、MHC-Ⅰ和MCH-Ⅱ類分子等。樹突狀細(xì)胞提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞免疫原性，提升相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)免疫能力［10］。另外，如為自體回輸方式，腫瘤免疫治療不存在自身免疫反應(yīng)等不良反應(yīng)［11］。

腫瘤分泌免疫抑制因子使得腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)調(diào)低，無法完成Fas/FasL誘導(dǎo)的凋亡。某些惡性腫瘤即使能表達(dá)Fas，但不一定能啟動(dòng)Fas/FasL介導(dǎo)下的凋亡［12］，甚至抑制Fas介導(dǎo)的凋亡［13］。成熟樹突狀細(xì)胞增強(qiáng)抗原提呈，F(xiàn)as/FasL介導(dǎo)的凋亡途徑激活，F(xiàn)as表達(dá)增加，引發(fā)Caspase酶系級(jí)鏈反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞程序性死亡。樹突狀細(xì)胞無直接殺傷作用，通過增強(qiáng)抗原提呈，提高免疫監(jiān)測(cè)，抑制腫瘤。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，NK等細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤有殺傷作用［14］，所以DC聯(lián)合殺傷細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤抑制作用的研究還有很大空間。

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（收稿2014-11-12）

R-332

A

1673-5110（2015）13-0035-03

腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血樹突狀細(xì)胞亞群變化和意義課題編號(hào)：黔科合J字〔2008〕2201

△通訊作者：謝明祥，神經(jīng)外科，學(xué)士，研究方向：腦膠質(zhì)瘤，E-mail：cba666＠126.com