裘紀(jì)瑩　陳相艷　劉孝永　王未名　周慶新　張翔　陳蕾蕾

摘要：為了檢測(cè)銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量，對(duì)銀杏花粉發(fā)酵飲料的水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)水解得到的3種苷元進(jìn)行了鑒定，采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)3種苷元的含量進(jìn)行了定量分析，并換算得到銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量，最后將高效液相色譜測(cè)定銀杏花粉總黃酮的方法與紫外分光光度計(jì)法、比色法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，優(yōu)化的銀杏花粉發(fā)酵飲料水解條件為鹽酸濃度0.6 mol/L，水解時(shí)間40 min。水解液中的3種苷元分別為槲皮素、山柰酚、異鼠李素。高效液相色譜法測(cè)定的銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量分別為21.40 mg/g、93.04 μg/mL。紫外分光光度計(jì)法和比色法準(zhǔn)確性低，干擾因素多，均不適用于銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮測(cè)定。

關(guān)鍵詞：銀杏；總黃酮；花粉；發(fā)酵飲料；含量測(cè)定；測(cè)定方法

中圖分類號(hào)： TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0371-03

銀杏是我國(guó)特有的珍稀植物，被稱為植物界的“活化石”。銀杏樹渾身是寶，其果、葉、苗具有重要的食用、藥用、觀賞價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外利用銀杏葉、銀杏果提取物開發(fā)出多種藥品、保健品。但是，關(guān)于銀杏花粉的研究比較少，國(guó)內(nèi)學(xué)者大多僅從生物學(xué)角度研究其形態(tài)特征、生長(zhǎng)發(fā)育、基本化學(xué)成分、人工授粉等，關(guān)于銀杏花粉產(chǎn)品開發(fā)及活性物質(zhì)研究還比較欠缺。筆者以銀杏花粉為原料，采用益生菌發(fā)酵技術(shù)，研制出銀杏花粉益生菌發(fā)酵飲料，采用高效液相色譜法測(cè)定銀杏花粉原料及發(fā)酵飲料中總黃酮的含量，旨在為開發(fā)利用銀杏資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏花粉采自山東省郯城縣，干燥過(guò)100目篩。銀杏花粉發(fā)酵飲料由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行研制。槲皮素、山柰酚、異鼠李素對(duì)照品（純度≥98%）均購(gòu)自山東省中藥化學(xué)對(duì)照品/標(biāo)準(zhǔn)品工程技術(shù)研究中心。 甲醇為色譜級(jí)；濃鹽酸、磷酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mettler AE240電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）， Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）， Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），UV-160型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），BK-120F 型超聲波清洗器（濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 待測(cè)樣品制備 參照王國(guó)霞等的方法[1]制備銀杏花粉樣品。精確吸取一定量的銀杏花粉發(fā)酵飲料，加入一定量的濃鹽酸、10 mL 100%甲醇，總體積為25 mL，閉塞后在天平上精確稱質(zhì)量，加人沸水浴中水解一定時(shí)間，快速冷卻，再次稱質(zhì)量并用100%甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻并過(guò)濾，用0.45 μm濾膜過(guò)濾濾液，作為供試品溶液。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備 分別精確稱取干燥至恒質(zhì)量的槲皮素、山柰酚、異鼠李素對(duì)照品，加100%甲醇制成濃度分別為74、56、38 μg/mL的混標(biāo)溶液，再用0.45 μm濾膜過(guò)濾，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋不同倍數(shù)各進(jìn)樣10 μL，按色譜條件測(cè)定，以峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 液相色譜檢測(cè)條件 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，4.6 mm×150 mm，5 μm；甲醇-0.2%磷酸水溶液（50 ∶ 50）為流動(dòng)相，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 樣品測(cè)定及總黃酮計(jì)算 分別吸取各樣品溶液10 μL，注入液相色譜儀。將色譜圖中3種苷元的峰面積代入回歸方程進(jìn)行外標(biāo)法定量，求出樣品溶液濃度，再換算成樣品含量。每個(gè)樣品3次重復(fù)，取平均值?？傸S酮含量計(jì)算公式[2]如下：總黃酮含量=槲皮素含量×2.51+山柰酚含量×2.64+異鼠李素含量×2.39。

1.3.5 質(zhì)譜鑒定條件 檢測(cè)模式：正離子模式；離子源：ESI（+）；霧化氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10.0 L/min；霧化氣壓：30 psi（206.85 kPa）；毛細(xì)管電壓：3 500 V；碎裂電壓：175 V；Skimmer電壓：65 V；八極射頻電壓：750 V；離子質(zhì)量掃描范圍：100～3 000 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋不同倍數(shù)各進(jìn)樣10 μL，以峰面積（Y）與溶液的濃度（X）進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r2），分別為：

槲皮素：Y=38.102X-13.101，r2=0.999 9；

山柰酚：Y=37.515X+1.308 4，r2=0.999 7；

異鼠李素：Y=92.980X-34.230，r2=0.999 9。

混合對(duì)照品溶液的色譜圖見圖1，此色譜條件下3種對(duì)照品在13 min內(nèi)得到良好的分離。

2.2 銀杏花粉3種苷元的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

采用高效液相色譜法檢測(cè)樣品中的黃酮苷元，銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的色譜圖分別如圖2、圖3所示，在混合對(duì)照品相同保留時(shí)間處均有出峰。

采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)銀杏花粉樣品中與對(duì)照品相同保留時(shí)間的組分進(jìn)行分析，質(zhì)譜圖見圖4。圖4-A組分的保留時(shí)間與槲皮素對(duì)照品一致，[M+H]+分子量為303.049 6，與槲皮素對(duì)照品一致，故鑒定為槲皮素。圖4-B組分的保留時(shí)間與山柰酚對(duì)照品一致，[M+H]+分子量為287.055 2，與山柰酚對(duì)照品一致，故鑒定為山柰酚。圖4-C組分的保留時(shí)間與異鼠李素對(duì)照品一致，[M+H]+分子量為317.065 3，與異鼠李素對(duì)照品一致，故鑒定為異鼠李素。endprint

2.3 銀杏花粉發(fā)酵飲料水解酸度、水解時(shí)間選擇

選取3份銀杏花粉發(fā)酵飲料，采用不同的鹽酸濃度、時(shí)間進(jìn)行供試品溶液制備，結(jié)果如表1所示。

張平安等在對(duì)銀杏葉及其提取物進(jìn)行酸水解時(shí)發(fā)現(xiàn)，用1.5 mol/L鹽酸水解效果最好[2]。王國(guó)霞等采用25 mL水解液（V甲醇 ∶ V25%鹽酸=4 ∶ 1）水解銀杏花粉，水解時(shí)間為40 min，結(jié)果表明，銀杏花粉郯城02的槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量分別為0.33、7.83、0.10 mg/g，總黃酮含量為21.74 mg/g[1]。鹽酸濃度過(guò)低時(shí)水解不充分，濃度過(guò)高時(shí)苷元容易降解；將發(fā)酵飲料冷凍干燥后測(cè)得的總黃酮為94.59 μg/mL，發(fā)酵飲料直接水解測(cè)定的總黃酮含量只有39.83 μg/mL?？梢姡l(fā)酵飲料直接加水解液水解的方法導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。原因是發(fā)酵飲料中90%以上是水，而銀杏花粉總黃酮的含量較低，加入25 mL水解液（V甲醇 ∶ V25%鹽酸=4 ∶ 1）后，鹽酸濃度被進(jìn)一步稀釋， 導(dǎo)致發(fā)酵飲料中的黃酮水解不充分。如果將發(fā)酵飲料冷凍干燥后測(cè)定固然結(jié)果比較準(zhǔn)確，但是耗時(shí)耗力，成本較高。如表1所示，在一定量的銀杏花粉發(fā)酵飲料中加入一定量的濃鹽酸、10 mL 100%甲醇，總體積為25 mL，25 mL體系中的鹽酸濃度分別為0.60、0.36 mol/L，分別水解30、40 min，結(jié)果表明，13.75 mL發(fā)酵飲料中加1.25 mL濃鹽酸、10 mL 100%甲醇，水解40 min的總黃酮含量最高，為93.04 μg/mL，與發(fā)酵飲料凍干粉的測(cè)定結(jié)果非常接近?？梢?，采用此方法對(duì)包括銀杏花粉發(fā)酵飲料在內(nèi)的銀杏花粉稀溶液進(jìn)行水解，操作方法比較簡(jiǎn)單，同時(shí)測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確。

2.4 高效液相色譜法與分光光度計(jì)法的比較

采用分光光度計(jì)測(cè)定總黃酮含量主要有紫外分光光度計(jì)法[3]、比色法[4] 2種方法。3種方法測(cè)定銀杏花粉及其發(fā)酵飲料總黃酮含量見表2、表3。

由表2、表3可知，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定銀杏花粉的總黃酮含量是采用比色法的3.7～3.9倍，是采用高效液相色譜法的2.3～2.5倍。采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定發(fā)酵飲料的總黃酮含量是比色法的4.37倍，是高效液相色譜法的6.27倍。用乙酸乙酯提取發(fā)酵飲料后，采用3種方法測(cè)定的總黃酮含量均明顯下降。紫外分光光度計(jì)法是利用黃酮類化合物在200～400 nm區(qū)域內(nèi)有很強(qiáng)的吸收帶，在258 nm處有1個(gè)最大吸收峰，在360 nm處也有1個(gè)肩峰。這使得利用紫外吸收作為評(píng)價(jià)黃酮含量指標(biāo)成為可能。該方法簡(jiǎn)單，但易受底液、干擾組分、溶液渾濁、吸收池不干凈的影響。從發(fā)酵飲料乙酸乙酯提取前后的巨大差異可知，此方法準(zhǔn)確度最差，非黃酮組分對(duì)結(jié)果影響很大，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。比色法是當(dāng)前測(cè)定總黃酮使用最為廣泛的方法，以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品，利用黃酮類化合物官能團(tuán)中的3-或5-OH及鄰二酚羥基與Al3+絡(luò)合，形成黃色物質(zhì)，再加入NaOH生成紅色，在510 nm處有最大吸收峰，但此方法結(jié)果易受底液、干擾組分等的影響。郭亞健等研究結(jié)果顯示，黃酮類成分黃芩苷、黃芩素、香蒲新苷、山柰酚、槲皮素、橙皮苷在500 nm左右處無(wú)吸收或吸收較弱，非黃酮類成分咖啡酸、原兒茶醛、綠原酸、原兒茶酸在波長(zhǎng)500 nm左右處有最大吸收或吸收較強(qiáng)，香草醛、阿魏酸等也有一定吸收[5]。此方法專屬性不強(qiáng)，有局限性，準(zhǔn)確性較差。從液相檢測(cè)結(jié)果可知，銀杏花粉水解后的苷元主要是山柰酚，還有少量槲皮素、異鼠李素。本研究結(jié)果表明，山柰酚對(duì)照品在500 nm左右處幾乎無(wú)吸收，槲皮素也只有較弱吸收，故比色法測(cè)定銀杏花粉時(shí)結(jié)果偏低。由于發(fā)酵飲料成分比較復(fù)雜，顏色偏深，影響比色法測(cè)定，導(dǎo)致結(jié)果偏高。比色法不適合用于銀杏花粉及其發(fā)酵飲料總黃酮含量的測(cè)定。采用高效液相色譜法測(cè)定銀杏花粉發(fā)酵飲料總黃酮，用乙酸乙酯提取后的總黃酮含量下降較多，主要是因?yàn)樘崛〔怀浞忠约胺蛛x、回收提取液時(shí)的損耗較大。又因?yàn)椴捎酶咝б合嗌V法時(shí)雜質(zhì)組分及色澤對(duì)發(fā)酵飲料總黃酮測(cè)定結(jié)果幾乎無(wú)影響，故只要將銀杏花粉發(fā)酵飲料直接水解即可上機(jī)測(cè)定。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，紫外分光光度計(jì)法、比色法均不適用于銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮測(cè)定，高效液相色譜法專一性強(qiáng)，雜質(zhì)和色澤影響小，準(zhǔn)確度、精確度高，適用于銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量測(cè)定。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)水解液的3種苷元進(jìn)行鑒定，3種苷元分別為槲皮素、山柰酚、異鼠李素。銀杏花粉及其發(fā)酵飲料應(yīng)采用不同的酸水解方式。發(fā)酵飲料的酸水解宜直接添加濃鹽酸，以便提高水解液體系中的鹽酸濃度，使水解更加充分。同時(shí)注意鹽酸添加量也不宜過(guò)高，一方面過(guò)高鹽酸含量會(huì)造成黃酮苷元的降解，另一方面也會(huì)變相稀釋銀杏花粉發(fā)酵飲料，導(dǎo)致其中低濃度的苷元不易檢出。采用25 mL水解液體系鹽酸濃度0.6 mol/L水解40 min比較合適。采用高效液相色譜法檢測(cè)了銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量。銀杏花粉的總黃酮含量平均為21.40 mg/g，發(fā)酵飲料的總黃酮含量為93.04 μg/mL，此含量比培養(yǎng)液滅菌和接種前略低，主要原因可能是滅菌時(shí)的高溫降解以及微生物生物轉(zhuǎn)化的影響。

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