蘇媛　劉雪靜　尹寶重　甄文超

摘要：以豐香、童子一號、全明星、森格那、達(dá)賽萊克特5個品種草莓組培苗為試材，以草莓枯萎病菌毒素作為選擇壓力，篩選草莓抗枯萎病突變體，對突變體再生植株與野生型植株的生長、分化進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，草莓枯萎病菌粗毒素對植株和莖尖生長點均有較強的毒害作用，經(jīng)粗毒素處理的植株可產(chǎn)生與枯萎病相似的癥狀。在毒素含量為10%的條件下繼代培養(yǎng)3次后，豐香品種的存活率上升最顯著；于毒素含量為15%的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)3次后，森格納、全明星品種的存活率上升最顯著。在15%毒素濃度下，繼代3次培養(yǎng)的草莓抗性不定芽存活率均不同程度低于10%毒素濃度，其中下降幅度最小的是全明星品種，僅為7.6%。在含有毒素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，AS-1、TZ-1抗性不定芽分化最為穩(wěn)定，分別比同品種的野生型不定芽高49.61%、50.38%；可見，在含有毒素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)可提高不定芽對毒素的抗性?？共⌒澡b定結(jié)果表明，突變體再生植株對枯萎病菌的抗性高于野生型再生植株。選用OPP-18特異性引物對TZ-1與童子一號品種進(jìn)行RAPD分析，電泳結(jié)果顯示，在750～1 000 bp之間存在特異性條帶；選用 OPO-05 引物對其進(jìn)行篩選，擴增出清晰可辨的3條非特異性條帶，表明所獲得的抗性植株與野生型植株在基因水平上發(fā)生了改變，可被認(rèn)定為突變體。

關(guān)鍵詞：枯萎病菌毒素；草莓；枯萎?。豢剐圆欢ㄑ?；篩選；RAPD分析

中圖分類號：S436.68+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0158-04

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬于薔薇科草莓屬，在果樹生產(chǎn)中占有重要地位。目前，中國草莓栽培面積、產(chǎn)量分別約為13.5萬 hm2、200萬 t，均居世界首位。中國草莓產(chǎn)區(qū)廣泛采用設(shè)施栽培，并由于耕地數(shù)量的限制，使連作面積不斷上升。連作草莓生長發(fā)育不良、土傳根部病害均日趨嚴(yán)重，被稱為連作障礙[1-2]。草莓枯萎病是一種由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl. f. sp. fragariae）侵染引起的真菌病害，對草莓的生長和產(chǎn)量造成很大影響，而連作障礙會顯著增加草莓枯萎病的發(fā)生。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)土壤消毒處理地塊的草莓第2年連作枯萎病發(fā)病率達(dá)90%，減產(chǎn)超過20%；第3年連作發(fā)病率達(dá)100%，減產(chǎn)超過40%[3]。目前，對草莓連作障礙的防治大多采用種植前的土壤消毒，常用化學(xué)藥劑有溴甲烷、氯化苦、棉隆、威百畝等。化學(xué)藥劑效果明顯，但均存在不同程度的毒性大、污染環(huán)境、操作技術(shù)嚴(yán)格等問題。

植物病原菌毒素是植物病原菌產(chǎn)生的對寄主植物具有毒性的代謝產(chǎn)物，是導(dǎo)致植物病害發(fā)生的主要原因之一[4-5]。離體條件下篩選植物抗病突變體，是結(jié)合植物組織培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用病菌毒素或類似毒素的化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞水平上選擇抗病突變體，是高等植物抗病育種的一種嘗試[6]。劉海瑞等研究了香蕉抗枯萎病突變體，以香蕉枯萎病菌產(chǎn)生的致病毒素為選擇壓力，在短期內(nèi)離體誘發(fā)和篩選抗香蕉枯萎病的突變體，提出簡便可行的篩選和鑒定方案[7]。黃麗麗等利用紫外線誘變的方法選育出小麥條銹菌病突變體，該突變體抗病性強、抗性穩(wěn)定[8]。趙明敏等以茄子黃萎病菌毒素作為選擇劑，離體篩選茄子抗黃萎病突變體，并對不同抗性的茄子幼苗、愈傷組織進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)果表明茄子愈傷組織能夠較好地表達(dá)植株水平的抗性[9]。本研究以草莓的莖尖生長點為試材，采用病原菌毒素作為選擇壓力進(jìn)行誘變處理，離體篩選草莓抗枯萎病突變體，比較突變體與野生型植株的基因型，確保植株水平與分子水平的一致性，旨在為草莓抗病突變體離體篩選程序的確定，及愈傷組織早期抗性鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草莓品種為豐香、童子一號、全明星、森格那、達(dá)賽萊克特。供試病原菌為尖孢鐮刀菌草莓?；?，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植病生態(tài)學(xué)研究室分離得到。

1.2 試驗方法

1.2.1 枯萎病菌毒素的制備和毒性測定 將尖孢鐮刀菌在PDA平板擴繁，從菌落邊緣切取直徑為5 mm的菌絲片，轉(zhuǎn)接至裝有150 mL Czpeks培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶5片，于 25 ℃、110 r/min條件下，12 h交替振蕩培養(yǎng)14 d；培養(yǎng)完成后經(jīng)4層紗布過濾，以5 000 r/min離心20 min，取上清液并用0.45 μm 孔徑的微孔濾膜加壓過濾，得到的無菌濾液即為毒素原液[10]。將毒素以10倍濃度梯度稀釋后澆灌長勢基本相同的草莓植株，每株澆灌15 mL，于25 ℃、光周期14 h光/10 h 暗條件下培養(yǎng)20 d，觀察其根部癥狀。

1.2.2 草莓抗枯萎病不定芽的篩選 將草莓莖尖（0.1～0.3 mm）分別接種于含毒素原液5%、10%、15%、20%的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計外植體存活率，確定毒素的半致死劑量，以不含毒素的培養(yǎng)基為對照。每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)20個莖尖。采用多步選擇法逐級加壓篩選：將草莓外植體在含有半致死劑量毒素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次后，挑選生長較好的愈傷組織，將其轉(zhuǎn)入毒素濃度高1個梯度的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次，每個繼代周期為30 d，培養(yǎng)完成后調(diào)查外植體生長狀況。將篩選出的抗性不定芽和野生型不定芽于照度3 000 lx、光周期14 h光/10 h暗、溫度20～28 ℃條件下生根培養(yǎng)30 d，之后添加10%無菌毒素并繼續(xù)培養(yǎng)30 d，測定株高、根長、新生葉片數(shù)、干物質(zhì)質(zhì)量。以接種于無毒素培養(yǎng)基的植株為對照。

1.2.3 RAPD檢測 草莓葉片基因組DNA的提取采用CTAB法，向常規(guī)CTAB基本提取液中添加1%PVP、1%維生素C、10 mmol/L Na2S2O5、2%β-巰基乙醇[11]。

草莓RAPD-PCR反應(yīng)體系為：10 mmol/L Tris-HCl（pH值9.0）、50 mmol/L KCl、0.1 mmol/L dNTPs、2.1 mmol/L MgCl2、15 ng引物、20 ng模板、IU TaqDNA聚合酶。反應(yīng)體積為25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，37 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，42個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，經(jīng)EB染色后在紫外燈下觀察[12]。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 枯萎病菌毒素毒力的測定

經(jīng)毒素處理的草莓植株可產(chǎn)生與枯萎病相似的癥狀，表明毒素對草莓植株有較強的致病作用，可作為篩選抗枯萎病突變體的選擇劑[13-14]。毒素對草莓植株的毒害作用隨著其濃度的增加而增強。經(jīng)毒素處理的草莓幼苗根部褐變，葉片邊緣枯萎，株高、根長、葉片數(shù)均低于對照，植株長勢衰弱（圖1）。

2.2 毒素選擇壓力的確定

由表1可知，不同劑量毒素對所有品種草莓莖尖的生長均有抑制作用，但品種間差異較大。全明星品種對毒素濃度的變化最為敏感，在10%毒素濃度選擇壓力下，其外植體存活率僅為6.2%，相當(dāng)于對照處理的6.9%；其次為豐香品種，其外植體存活率在10%毒素濃度選擇壓力下僅為39.8%，相當(dāng)于對照處理的44.2%；當(dāng)毒素濃度升至15%時，二者均未檢測到存活的外植體。森格納品種對毒素選擇壓力的抗性最高，當(dāng)毒素濃度選擇壓力為15%時，其存活率高達(dá)45.1%，顯著高于相同濃度下的其他品種。當(dāng)毒素濃度進(jìn)一步提升至20%時，森格納品種的存活率仍達(dá)到6.2%，而其他品種的外植體則全部褐變死亡。可見，15%毒素含量可作為森格納品種草莓抗性突變體的篩選壓力，其余4個品種的選擇壓力則為10%毒素含量。

2.3 抗性不定芽存活率穩(wěn)定性測定

5個品種的草莓在含毒素培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3代后，外植體存活率均有所提高（表2）。在毒素含量為10%的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次后，豐香品種存活率上升幅度最大，顯著提高59.6百分點；童子一號、達(dá)賽萊克特品種次之，存活率分別提高22.5、20.1百分點；全明星品種無顯著變化。在毒素含量為15%的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3次后，森格納、全明星品種存活率上升幅度最大，顯著提高30.0、29.3百分點；豐香、童子一號品種次之，分別提高20.5、17.8百分點；達(dá)賽萊克特品種存活率提高幅度最小。對比不同毒素濃度下的繼代培養(yǎng)結(jié)果可知，15%毒素濃度下繼代3次培養(yǎng)的草莓抗性不定芽，其存活率均不同程度低于10%毒素濃度。其中，下降幅度最小的全明星品種僅為7.6百分點，而下降幅度最大的達(dá)賽萊克特品種達(dá)到42.4百分點?？梢?，逐步提高毒素濃度將使外植體的存活率下降，不同品種草莓對毒素的抗性不同。經(jīng)粗毒素連續(xù)篩選得到的抗性不定芽，對枯萎病菌毒素具有較為穩(wěn)定的抗性。

2.4 抗性不定芽抗毒素分化穩(wěn)定性測定

對篩選到的5個毒素抗性較強的不定芽進(jìn)行命名。將全明星品種經(jīng)篩選得到的2個不定芽分別命名為AS-1、AS-2；將童子一號品種經(jīng)篩選得到的不定芽命名為TZ-1；將達(dá)賽萊克特品種經(jīng)篩選得到的不定芽命名為DA-1；將森格納品種經(jīng)篩選得到的不定芽命名為SE-1。對上述5個不定芽進(jìn)行抗毒素分化能力測定，結(jié)果（表3）表明，在相同繼代次數(shù)對照培養(yǎng)基培養(yǎng)下，5個抗性不定芽與相應(yīng)品種野生型不定芽的分化程度無顯著差異。在含有毒素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，AS-1、TZ-1抗性不定芽分化最為穩(wěn)定，分別高于同品種野生型不定芽49.61%、50.38%；其他3個抗性不定芽的穩(wěn)定性與同品種野生型不定芽相比顯著提高，平均提高 28.54%。

2.5 草莓抗枯萎病突變體的RAPD分析

選取毒素抗性較好的不定芽進(jìn)行分子鑒定，提取AS-1、TZ-1、全明星、童子一號品種草莓基因組DNA（圖2），所提取的DNA呈無色透明狀，易溶于TE溶液。草莓基因組DNA在0.7%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果表明，DNA提取量較多，DNA完整無降解，可直接用于試驗。選用引物OPP-18對全明星、AS-1、童子一號、TZ-1品種草莓基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性分析（圖3），樣品在1.4%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果表明，全明星、AS-1品種的條帶存在差異，在750～1 000 bp 存在特異性條帶。幾次試驗的重復(fù)性較高，可擴增得到穩(wěn)定的特異性條帶，因此可利用引物OPP-18區(qū)分全明星、AS-1品種。使用引物OPO-05篩選時并未擴增出特異性條帶，但全明星、AS-1品種的條帶亮度不同（圖4）。選用引物 OPP-18 對TZ-1、童子一號品種草莓DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，在1.2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果表明，TZ-1、童子一號品種的條帶存在差異，在750～1 000 bp存在特異性條帶。幾次試驗的重復(fù)性較高，可擴增得到穩(wěn)定的特異性條帶。使用引物OPO-05篩選時并未擴增出特異性條帶，而擴增出3條清晰可辨的非特異性條帶。結(jié)果表明，所獲得的抗性植株與野生型植株在DNA水平（即堿基）發(fā)生了改變，可被認(rèn)為是突變體。而這些多態(tài)性位點是否與抗枯萎病有關(guān)仍需進(jìn)一步鑒定。

3 結(jié)論與討論

以毒素作為選擇壓力篩選草莓抗枯萎病突變體時，毒素選擇壓力小不易于篩選出高抗材料；選擇壓力大則導(dǎo)致芽存活率低，不利于篩選工作的進(jìn)行。多數(shù)研究者認(rèn)為，篩選時采用半致死水平的濃度較為合理[15]。本研究采用草莓枯萎病菌粗毒素處理草莓植株，發(fā)現(xiàn)其對植株具有較強的毒害作用，使植株產(chǎn)生與枯萎病相似的癥狀[16]。進(jìn)一步篩選毒素選擇壓力時發(fā)現(xiàn)，采用15%毒素含量（半致死劑量）作為森格納品種的篩選壓力，并采用10%毒素含量作為豐香、童子一號、全明星、達(dá)賽萊克特品種的篩選壓力，篩選抗性不定芽時取得了較好的誘導(dǎo)效果，這與前人的研究結(jié)論相一致。

目前，大多采用正選擇法從作物中獲得抗病突變體[17]，即確定篩選壓力后逐步遞增毒素濃度，逐步提高外植體的抗性[18]。此方法獲得的材料抗性穩(wěn)定，避免突變體因無法適應(yīng)毒素濃度的突然增大而死亡。本研究采用正選擇法得出結(jié)論，在15%毒素濃度下繼代3次培養(yǎng)的草莓抗性不定芽，其存活率均不同程度低于10%毒素濃度。其中，下降幅度最小的全明星品種僅為7.6%。對篩選得到的突變體進(jìn)行室內(nèi)接種試驗，測定毒素抗性較強的不定芽的分化穩(wěn)定性。在含毒素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，AS-1、TZ-1抗性不定芽分化最為穩(wěn)定，分別高于同品種野生型不定芽49.61%、50.38%；因此，在含毒素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)可提高不定芽對毒素的抗性。通過RAPD分析可知，TZ-1、童子一號品種的條帶存在差異，在750～1 000 bp存在特異性條帶（1.2%瓊脂糖凝膠電泳）；采用引物OPO-05對其進(jìn)行篩選，擴增出3條清晰可辨的非特異性條帶，表明所獲得的抗性植株與野生型植株在DNA水平上發(fā)生了改變。RAPD檢測到的非特異性條帶是否與枯萎病抗性有關(guān)，以及抗性不定芽在田間的抗病表現(xiàn)仍須進(jìn)一步研究。endprint

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