余夢(mèng)瑤，許曉燕，魏 巍，江 南，邱欣玉，2，羅 霞**

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610041）

〈生理生化〉

38株靈芝子實(shí)體抗腫瘤質(zhì)量的生物評(píng)價(jià)*

余夢(mèng)瑤1，許曉燕1，魏 巍1，江 南1，邱欣玉1，2，羅 霞1**

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610041）

針對(duì)38株靈芝子實(shí)體樣品，開展醇提物抑制HeLa、SK-OV-3腫瘤細(xì)胞增殖活性和三萜含量測(cè)定研究，對(duì)其抗腫瘤質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選具有開發(fā)抗腫瘤產(chǎn)品潛力的優(yōu)質(zhì)菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，33號(hào)、34號(hào)2株靈芝對(duì)HeLa細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷作用，對(duì)2株細(xì)胞增殖抑制IC50分別為16.55 μg·mL-1、10.2 μg·mL-1和31.9 μg·mL-1、30.64 μg·mL-1，可作為優(yōu)質(zhì)資源進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)。各菌株靈芝子實(shí)體的三萜含量在1.372 mg·g-1～6.184 mg·g-1之間，不同菌株子實(shí)體間三萜含量差異較大，細(xì)胞增殖抑制活性與三萜含量間不具有相關(guān)性，提示靈芝抗腫瘤原料質(zhì)量評(píng)價(jià)宜考慮補(bǔ)充生物質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

靈芝；抗腫瘤；三萜；生物評(píng)價(jià)

靈芝屬真菌具有廣泛的藥理活性，具有悠久的藥用歷史，廣泛收錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》、《名醫(yī)別錄》、《本草綱目》等歷代典籍之中。臨床研究表明，靈芝在腫瘤輔助治療方面具有較好的療效[1]。藥理研究表明，靈芝抗腫瘤有效組分主要為靈芝多糖和靈芝三萜[2]，其中靈芝三萜類成分具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[3]，其作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)[4]。

目前，對(duì)靈芝藥材質(zhì)量控制的主要方法是測(cè)定其總多糖和總?cè)坪?。但是，由于栽培菌株繁多，栽培條件難以精確控制，靈芝作為真菌這一“高創(chuàng)造系數(shù)”的生物資源[5]，次生代謝產(chǎn)物的生成受到遺傳、發(fā)育階段、環(huán)境的三重影響，其總?cè)频漠a(chǎn)量和組分比例變化巨大[6]。盡管研究報(bào)道，采用指紋圖譜技術(shù)構(gòu)建了靈芝三萜的指紋特征與其腫瘤抑制率之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度[7]，但由于缺乏內(nèi)控指標(biāo)、方法較為復(fù)雜、易受操作影響等，其應(yīng)用尚不廣泛。

中藥質(zhì)量的生物活性評(píng)價(jià)具有整體可控、藥效相關(guān)等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，作為符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的適用質(zhì)量控制模式及方法，逐漸成為中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的重要發(fā)展方向之一[8]。如板藍(lán)根顆粒已建立基于化學(xué)組分分析—生物測(cè)定關(guān)聯(lián)分析的質(zhì)量控制方法[9]。

本研究針對(duì)38株栽培靈芝子實(shí)體，分別測(cè)定其醇提物對(duì)HeLa、SK-OV-3細(xì)胞增殖抑制IC50和總?cè)坪?，以期評(píng)價(jià)不同靈芝子實(shí)體的藥材質(zhì)量，為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)資源，同時(shí)為今后靈芝抗腫瘤質(zhì)量的生物評(píng)價(jià)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 靈芝

靈芝菌株38株，由山東省泰安市農(nóng)科院食用菌研究所在統(tǒng)一條件下袋料栽培，其編號(hào)及名稱詳見表1。

表1 38個(gè)靈芝菌株編號(hào)及名稱Tab.1 The list of 38 Ganoderma lucidum strains

1.1.2 細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液（含NaHCO31.5 g·L-1、青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100 U·mL-1） 置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d～3 d傳代1次。

1.1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；MTT、胰酶、EDTA購自Sigma公司；齊墩果酸購自中國藥檢所，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1 樣品制備

各靈芝子實(shí)體粉碎后，置于50℃的烘箱中烘干。準(zhǔn)確稱取10 g靈芝粉末，加入20倍體積95%乙醇，50℃超聲提取1 h，過濾，重復(fù)提取1次，合并濾液，將濾液減壓蒸干，獲得靈芝乙醇提取物。稱取靈芝乙醇提取物，以DMSO準(zhǔn)確配制成100 mg·mL-1溶液，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 靈芝乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，胰酶消化，制備細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔加入細(xì)胞懸液180 μL，每孔接種6×103個(gè)細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入靈芝乙醇提取物溶液20 μL，使樣品終濃度分別為100 μg·mL-1、31.6 μg·mL-1、10 μg·mL-1、3.16 μg·mL-1、1 μg·mL-1，同時(shí)設(shè)置空白孔和對(duì)照孔，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞板繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，加入100 μL PBS溶液和10 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入100 μL10%SDS溶液（0.01 mol·L-1HCl配制），待甲臢結(jié)晶溶解后，570 nm處測(cè)定吸光度。按以下公式計(jì)算抑制率（P，%）：

P=（OD1-OD2）×100%/（OD1-OD3）

式中：OD1表示對(duì)照組OD值；OD2表示樣品組OD值；OD3表示空白組OD值。

采用Curve Expert軟件，計(jì)算各株靈芝子實(shí)體乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50。

1.2.3 靈芝三萜的測(cè)定

靈芝三萜含量參照文獻(xiàn) [10]方法測(cè)定。

1.2.4 相關(guān)性分析

選擇腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50＜100 μg·mL-1的樣品，對(duì)其腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50與三萜含量，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1靈芝乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的影響

靈芝乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50與子實(shí)體三萜含量見表2。

表2 靈芝乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50與子實(shí)體三萜含量Tab.2 The IC50of ethanol extracts on tumor cells proliferativeinhibition and the triterpene content of 38 Ganoderma lucidum strains

在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同靈芝子實(shí)體乙醇提取物后，HeLa和SK-OV-3細(xì)胞增殖均出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)變化，折光度減弱，細(xì)胞數(shù)量減少，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，但不同樣品的抑制效果有明顯差異。經(jīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50計(jì)算發(fā)現(xiàn)，38個(gè)靈芝樣品中，有23個(gè)樣品對(duì) HeLa增殖抑制 IC50＜100 μg·mL-1，占總數(shù)的60.53%；有8個(gè)靈芝樣品對(duì)SK-OV-3細(xì)胞增殖抑制IC50＜100 μg·mL-1，占總數(shù)的21.05%。所有樣品中，33號(hào)、34號(hào)2株靈芝對(duì)HeLa細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷作用，對(duì)2株細(xì)胞增殖抑制IC50分別為16.55 μg·mL-1、10.2 μg·mL-1和31.9 μg·mL-1、30.64 μg·mL-1。

2.2靈芝子實(shí)體三萜含量

靈芝子實(shí)體三萜含量測(cè)定結(jié)果如表2所示，各靈芝子實(shí)體的三萜含量在1.372 mg·g-1～6.184 mg·g-1之間，不同菌株子實(shí)體間三萜含量差異較大，含量最低的34號(hào)與含量最高的40號(hào)樣品之間，三萜含量相差達(dá)4.5倍。

2.3相關(guān)性分析

從表2中可以看出，38個(gè)靈芝樣品的三萜含量與乙醇提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50間無明顯必然聯(lián)系，腫瘤增殖抑制活性最高的33號(hào)、34號(hào)2個(gè)樣品，其三萜含量?jī)H為2.778 mg·g-1和1.372 mg·g-1，而三萜含量較高的27號(hào)樣品，其對(duì)HeLa和SKOV-3細(xì)胞增殖抑制IC50均超過了100 μg·mL-1。腫瘤細(xì)胞增殖IC50與三萜含量相關(guān)性分析見圖1。

選擇IC50＜100 μg·mL-1的樣品進(jìn)行IC50與三萜含量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，其散點(diǎn)圖呈散布式分布，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞增殖抑制IC50與三萜含量間的相關(guān)系數(shù)分別為0.124和0.253，但其無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），表明腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50與三萜含量間不存在相關(guān)性。

3 討論

靈芝在腫瘤輔助治療方面的療效，在臨床已得到普遍認(rèn)同[11]，并得到大量體內(nèi)外藥理研究證實(shí)[12]。本研究通過對(duì)38株靈芝子實(shí)體開展其醇提物對(duì)HeLa、SK-OV-3細(xì)胞增殖抑制活性和總?cè)坪康臏y(cè)定研究，篩選獲得33號(hào)、34號(hào)2株具有顯著體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制的菌株，可為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。

圖1 腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50與三萜含量相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis on the IC50of tumor cells proliferative inhibition and the triterpene content

本研究采用體外細(xì)胞試驗(yàn)，觀察靈芝醇提物對(duì)HeLa、SK-OV-3細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝子實(shí)體醇提物對(duì)2種細(xì)胞株增殖均有抑制作用，與前人結(jié)果相符。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，靈芝子實(shí)體醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的作用強(qiáng)弱有較大差異，HeLa細(xì)胞對(duì)靈芝醇提物更為敏感，提示靈芝抗腫瘤作用可能存在一定的組織來源差異性。

本研究對(duì)在相同條件下栽培的不同靈芝菌株子實(shí)體三萜含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其三萜含量存在明顯差異，表明靈芝的遺傳背景與三萜形成密切相關(guān)。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，靈芝子實(shí)體總?cè)坪颗c腫瘤細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)間無相關(guān)性，分析可能原因可能為：一是靈芝子實(shí)體中除三萜類成分外，還含有其他的抗腫瘤活性成分，如生物堿、甾醇類成分[13]；二是不同三萜單體抗腫瘤活性差異較大，而不同靈芝子實(shí)體所含具有高抗腫瘤活性的三萜成分含量差異較大；三是一些三萜單體可能具有配伍效應(yīng)，而不同靈芝子實(shí)體三萜單體組成差異不同導(dǎo)致抗腫瘤活性差異?，F(xiàn)有靈芝質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍以總多糖和總?cè)坪繛橹?。本研究發(fā)現(xiàn)，就靈芝抗腫瘤產(chǎn)品開發(fā)需求而言，總?cè)频脑u(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)難以適應(yīng)產(chǎn)品對(duì)原料的質(zhì)量要求。生物質(zhì)量評(píng)價(jià)能夠直接反應(yīng)藥物的療效，通過生物質(zhì)量評(píng)價(jià)與先進(jìn)藥物分析技術(shù)的結(jié)合，能夠建立更為全面合理的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[14]。本研究初步發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞增殖抑制IC50測(cè)定方法相對(duì)簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，可作為靈芝生物質(zhì)量評(píng)價(jià)的一個(gè)候選方法。該方法可進(jìn)一步與指紋圖譜等技術(shù)相結(jié)合，建立靈芝抗腫瘤原料—中間物—產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為靈芝產(chǎn)品的現(xiàn)代化、國際化發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

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The Bio-assay on Anti-tumor Quality Evaluation of the Fruit Bodies of 38 Ganoderma lucidum Strains

YU Meng-yao1,XU Xiao-yan1,WEI Wei1,JIANG Nan1,QIU Xin-yu1,2,LUO Xia1
(1.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences,Chengdu 610041,China; 2.College of Life Science,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

In order to evaluate the anti-tumor quality of the fruit bodies of 38 Ganoderma lucidum strains,the IC50of proliferative inhibition on HeLa and SK-OV-3 cells and the triterpene content was measured.The IC50of two strains,No.33 and No.34, on HeLa and SK-OV-3 cells was 16.55 μg·mL-1,10.2 μg·mL-1and 31.9 μg·mL-1,30.64 μg·mL-1,respectively,which were identified as the potential materials for anti-tumor products developing.The triterpene content of the Ganoderma lucidum fruit bodies was between 1.372 mg·g-1to 6.184 mg·g-1,and was varied extensively in different strains.Meanwhile,the relationship between the activities of anti-tumor and triterpene content was not found.And it suggested that the bio-assay may be taken into consideration in the further anti-tumor quality evaluation of Ganoderma lucidum.

Ganoderma lucidum;anti-tumor;triterpene;bioassay evaluation

S646.9

A

1003-8310（2015）02-0047-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.013

菌類藥材研究與開發(fā)四川省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2011JTD0021）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013NZ0029）；四川省十二五育種攻關(guān)項(xiàng)目（2011NZ0098-12-04）；四川省食用菌精深加工研究崗位建設(shè)項(xiàng)目 [川農(nóng)業(yè)（2009）75號(hào)]；四川省微生物資源共享平臺(tái)——農(nóng)業(yè)微生物平臺(tái)項(xiàng)目；四川省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012NZ0003）。

余夢(mèng)瑤（1981-），男，博士，副研究員，主要從事菌類藥材方面研究。E-mail:yumengyao@gmail.com

**通信作者：羅霞（1974-），女，博士，研究員，主要從事菌類藥材方面研究。E-mail:lx1443_cn@sina.com

2014-12-19