唐和斌,李婷婷，楊燕京，陳倍璠，馬汝玉，顏海燕，李玉桑，奉黎靜

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷、缺失并伴有周圍骨病變?yōu)樘攸c(diǎn)的退行性病變，主要表現(xiàn)為軟骨表面纖維化、軟骨細(xì)胞和基質(zhì)蛋白多糖丟失、膠原基質(zhì)破壞、軟骨下骨外露及骨贅形成等[1].它是全球成年人最常見(jiàn)的骨性關(guān)節(jié)疾病，也是引起中老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因[2].理清OA模型中相關(guān)病理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化對(duì)認(rèn)識(shí)OA的形成、發(fā)展至關(guān)重要[3].關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶可誘導(dǎo)兔、豚鼠等動(dòng)物髖關(guān)節(jié)或膝骨關(guān)節(jié)炎，具有發(fā)病快、重復(fù)性好、與人類骨關(guān)節(jié)炎類似等特點(diǎn)，是常用的造模方式[4,5].目前對(duì)OA相關(guān)病理指標(biāo)的研究主要圍繞多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行單一時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)檢測(cè)[6]，對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)也僅僅針對(duì)1～2個(gè)指標(biāo)[7]，未全面涉及OA模型的疼痛指標(biāo)檢測(cè)、疼痛行為學(xué)反應(yīng)、炎癥因子、軟骨大體觀察評(píng)分和一般組織病理學(xué)指標(biāo)的連續(xù)變化.故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶誘導(dǎo)OA動(dòng)物模型，檢測(cè)上述相關(guān)病理指標(biāo)以探討OA大鼠關(guān)節(jié)炎形成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化.

1 材料和方法

1.1 試劑、儀器和動(dòng)物

木瓜蛋白酶(美國(guó)Amresco)，Rat IL-1β Platinum Elisa試劑盒(美國(guó)Ebioscience)，甲苯胺藍(lán)(上海源葉生物科技)，沙黃O(德國(guó)Applichem)，生理鹽水(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)).

手持式測(cè)痛儀(北京碩林苑)，游標(biāo)尺寸(上海臺(tái)海)，多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)，脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)(德國(guó)萊卡).

36只雄性Wistar大鼠(體重210～250 g，SPF級(jí)，4200695675,湖北省食品藥品安全性評(píng)價(jià)中心).

1.2 OA大鼠動(dòng)物分組及模型建立

36只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為A、B兩大組，A組為對(duì)照組(18只)，B組為模型組(18只)；其中A1、A2、A3分別為造模結(jié)束后第1、2、3周對(duì)照組(每組6只)，B1、B2、B3分別為造模結(jié)束后第1、2、3周模型組(每組6只).

造模開(kāi)始第1、4、7 d，于模型組大鼠左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4％木瓜蛋白酶生理鹽水溶液，每次注射量為100 μL，誘導(dǎo)OA大鼠模型[8].對(duì)照組大鼠左膝關(guān)節(jié)于上述時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水，作為正常對(duì)照.各組別分別于造模結(jié)束后第1、2、3周處死動(dòng)物采集樣品，期間進(jìn)行疼痛指標(biāo)檢測(cè)及疼痛行為學(xué)反應(yīng)觀察、關(guān)節(jié)滑液中,IL-1β含量檢測(cè)、關(guān)節(jié)軟骨大體觀察評(píng)分、一般病理學(xué)檢測(cè).無(wú)菌關(guān)節(jié)腔注射，注射前后以1％碘伏原液消毒.

1.3 疼痛指標(biāo)檢測(cè)及疼痛行為學(xué)反應(yīng)觀察

各組大鼠處死前檢測(cè)左膝關(guān)節(jié)的腫脹程度、壓痛閾值和大鼠行走疼痛記分.剃去左膝膝關(guān)節(jié)處毛發(fā)，運(yùn)用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左膝膝關(guān)節(jié)直徑寬度，以表明關(guān)節(jié)腫脹程度；運(yùn)用壓痛儀按壓大鼠左膝膝點(diǎn)，當(dāng)大鼠首次出現(xiàn)劇烈掙扎，顯示即為壓痛閾值，并計(jì)算相對(duì)壓痛閾值；于大鼠左右腳掌上均勻印上顏色深淺一致的印泥，于自制半封閉式大鼠行走通道上行走0.4 m，拍下腳掌印記照片，5人獨(dú)立的按照如下記分標(biāo)準(zhǔn)就腳掌照片進(jìn)行行走疼痛記分(當(dāng)肢體出現(xiàn)疼痛反應(yīng)，大鼠以爪子的最小接觸面積運(yùn)動(dòng)，可減小患肢壓力，而當(dāng)左右腳著力不均、步態(tài)發(fā)生改變時(shí)，則表現(xiàn)為腳掌顏色深淺不一[9]).

疼痛記分標(biāo)準(zhǔn)如圖1所示，腳掌分為4個(gè)區(qū)域：若左腳掌的1個(gè)區(qū)域顏色深于右腳掌，記1分；若有2個(gè)，記2分；依次累計(jì)(0～4分)，如圖1可判為4分.

①腳趾，②前腳掌，③后腳掌，④腳后跟

1.4 樣本采集及制備

處死大鼠，切開(kāi)左膝關(guān)節(jié)，暴露關(guān)節(jié)囊，抽取0.4 mL生理鹽水關(guān)節(jié)腔灌洗液，-80℃保存，待檢測(cè)關(guān)節(jié)滑液中IL-1β含量.切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，去除滑膜、交叉韌帶和半月板，暴露關(guān)節(jié)面，拍下軟骨正面觀，待大體觀察評(píng)分.截取左膝關(guān)節(jié)，10％福爾馬林固定，待染色評(píng)分.

1.5 關(guān)節(jié)滑液中IL-1β含量檢測(cè)

Elisa方法測(cè)定左膝關(guān)節(jié)滑液的炎癥因子IL-1β含量.

1.6 膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察評(píng)分

5人獨(dú)立的按照以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)就大鼠左膝軟骨正面觀進(jìn)行評(píng)分[10]. 0分：軟骨表面光滑呈無(wú)色半透明狀；1分：軟骨表面光滑，但有瑕疵；2分：軟骨表面光滑，呈乳白不透明狀；3分：軟骨表面不光滑，呈乳白不透明狀；4分：軟骨缺失，伴軟骨下骨外露.

1.7 關(guān)節(jié)軟骨一般組織病理學(xué)檢測(cè)

關(guān)節(jié)軟骨固定后，經(jīng)10％ EDTA室溫脫鈣，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，甲苯胺藍(lán)染色和沙黃O染色[11].5人獨(dú)立的按照Mankin′s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]就染色圖片評(píng)分(0～10分).

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

多組之間采用SPSS 19.0的Two-way ANOVA中的Dunnett進(jìn)行分析.

2 結(jié)果

2.1 疼痛指標(biāo)檢測(cè)及疼痛行為學(xué)反應(yīng)觀察

2.1.1 關(guān)節(jié)腫脹程度測(cè)定

左膝關(guān)節(jié)腫脹程度結(jié)果見(jiàn)圖2.如圖2所示，造模結(jié)束后第1、2、3周，模型組均出現(xiàn)明顯腫大現(xiàn)象，以第1周最明顯，說(shuō)明造模后大鼠出現(xiàn)較嚴(yán)重關(guān)節(jié)腫大現(xiàn)象，而第2、3周腫大情況緩解.

與對(duì)照組比較: **P<0.01, ***P<0.001;## 與第1周模型組比較: P<0.01

3.1.2 關(guān)節(jié)相對(duì)壓痛閾值的測(cè)定

左膝關(guān)節(jié)相對(duì)壓痛閾值結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可見(jiàn)，第1周模型組相對(duì)壓痛閾值明顯降低，說(shuō)明造模后大鼠出現(xiàn)明顯機(jī)械誘發(fā)疼痛，而第2、3周閾值均升高，其中第3周升高較明顯，第2、3周升高較第1周明顯.

與對(duì)照組比較:*P<0.05,***P<0.001;###與第1周模型組比較:P<0.001

3.1.3 行走疼痛記分的測(cè)定

行走疼痛記分結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可見(jiàn)，各周模型組的疼痛記分均增加，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第2、3周均較第1周模型組升高明顯.

#與第1周模型組比較: P<0.05

3.2 關(guān)節(jié)滑液中IL-1β含量檢測(cè)

左膝關(guān)節(jié)滑液中炎癥因子IL-1β含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5.圖5中各周模型組含量均升高，以第1周升高明顯，第2周達(dá)峰值，第3周降低.

** 與對(duì)照組比較: P<0.01

3.3 關(guān)節(jié)軟骨大體觀察評(píng)分及一般組織病理學(xué)檢測(cè)

3.3.1 關(guān)節(jié)軟骨大體觀察評(píng)分

左膝關(guān)節(jié)軟骨正面觀的代表圖見(jiàn)圖6.由圖6可見(jiàn)，第1、2、3周，對(duì)照組軟骨表面均呈無(wú)色半透明狀，光滑且無(wú)明顯病變癥狀；而模型組多有軟骨變薄，出現(xiàn)血絲，逐漸加重，第3周軟骨表面有磨損缺失現(xiàn)象，的趨勢(shì)，說(shuō)明軟骨表面損傷較嚴(yán)重.

A～C) 對(duì)照組1、2、3周；D～F) 模型組1、2、3周

圖7為左膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察評(píng)分.由圖7可見(jiàn)，各周模型組關(guān)節(jié)軟骨大體觀察評(píng)分均隨時(shí)間明顯升高，表明軟骨表面損傷，逐漸加重.

與對(duì)照組比較: *P<0.05,***P<0.001; ##與第1周模型組比較:P<0.01

3.3.2 關(guān)節(jié)軟骨光鏡下Mankin′s評(píng)分

圖8、9分別為左膝關(guān)節(jié)軟骨甲苯胺藍(lán)染色和沙黃O染色的代表圖.由圖8、9可見(jiàn)，第1、2、3周，對(duì)照組軟骨組織結(jié)構(gòu)完整、排列規(guī)則、無(wú)細(xì)胞增生現(xiàn)象、著色較為均勻；而各周模型組軟骨組織結(jié)構(gòu)較紊亂，細(xì)胞增生、著色降低，軟骨表面有破損，且逐漸加重.

A～C) 對(duì)照組1、2、3周；D～F) 模型組1、2、3周

表1為左膝關(guān)節(jié)軟骨光鏡下Mankind′s評(píng)分結(jié)果(0～10分).第1、2、3周，對(duì)照組記分逐漸升高；與相應(yīng)對(duì)照組比較，各周模型組評(píng)分值均明顯升高，結(jié)合相應(yīng)的組織一般病理學(xué)檢測(cè)，表明模型大鼠的軟骨損傷嚴(yán)重.

與對(duì)照組比較:**P< 0.01,***P< 0.001

3 討論

本文通過(guò)對(duì)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)OA模型大鼠的疼痛指標(biāo)檢測(cè)、疼痛行為學(xué)反應(yīng)觀察、關(guān)節(jié)滑液中IL-1β含量、軟骨大體觀察評(píng)分和軟骨一般病理學(xué)等指標(biāo)的檢測(cè)，進(jìn)行了木瓜蛋白酶誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎模型的動(dòng)態(tài)變化研究.

通過(guò)測(cè)定疼痛指標(biāo)及疼痛行為學(xué)反應(yīng)觀察，反映OA形成過(guò)程中疼痛反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化. 造模結(jié)束后第1周，造模組的關(guān)節(jié)明顯腫大且壓痛閾值降低，第 2、3周的腫脹現(xiàn)象有所緩解，但壓痛閾值反而逐漸升高.軟骨本身不受神經(jīng)支配，不能感知疼痛，而OA疼痛主要來(lái)源于非軟骨的關(guān)節(jié)內(nèi)和關(guān)節(jié)周圍組織結(jié)構(gòu)，如邊緣骨增生導(dǎo)致的骨膜掀起，暴露的軟骨下骨壓力升高等[13，14]；機(jī)械誘發(fā)疼痛僅針對(duì)接觸部位檢測(cè)，對(duì)OA疼痛檢測(cè)并不完全故本文通過(guò)行走疼痛記分從機(jī)體整體步態(tài)上評(píng)估OA疼痛反應(yīng)，可避免一般機(jī)械誘發(fā)疼痛，能客觀、快速地量化多個(gè)指標(biāo)[9,15].疼痛記分結(jié)果顯示：各周模型組疼痛記分逐漸增加，說(shuō)明木瓜蛋白酶誘導(dǎo)OA模型出現(xiàn)了明顯的疼痛反應(yīng)，且有逐漸加重的趨勢(shì).

通過(guò)檢測(cè)關(guān)節(jié)滑液中IL-1β含量水平，反映OA形成過(guò)程中關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥因子的動(dòng)態(tài)變化.Elisa結(jié)果顯示造模后出現(xiàn)急性炎癥，且于第2周達(dá)到峰值.第1、2周，關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)急性炎癥，而第3周可能隨基質(zhì)蛋白和肉芽組織的形成，急性炎癥得以緩解，IL-1β含量回落[7,8].IL-1β在OA病理過(guò)程中能促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解和軟骨細(xì)胞的破壞，其在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的高表達(dá)與關(guān)節(jié)內(nèi)組織的急性炎癥和急性損傷有關(guān)[16]，故需進(jìn)一步檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨大體觀察和Mankin′s評(píng)分以判斷軟骨損傷情況.

結(jié)果第1、2、3周，模型組的兩項(xiàng)評(píng)分均明顯升高，且有逐漸加重的趨勢(shì)，說(shuō)明軟骨表面損傷較為嚴(yán)重，一般組織病理學(xué)特征有較明顯變化，且不斷加重.而IL-1β含量水平并不隨軟骨損傷的進(jìn)行性加重而不斷升高[7]，而是在第2周出現(xiàn)峰值后回落.

綜上所述，木瓜蛋白酶誘導(dǎo)OA模型形成過(guò)程中，出現(xiàn)明顯步態(tài)變化，同時(shí)軟骨損傷與疼痛行為學(xué)變化趨勢(shì)相一致，與IL-1β含量變化趨勢(shì)不一致，而IL-1β的變化趨勢(shì)與關(guān)節(jié)腫脹程度、相對(duì)壓痛閾值變化趨勢(shì)較為接近.提示木瓜蛋白酶誘導(dǎo)OA模型形成初期(1～2周)，出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng)，患處分泌的炎癥因子明顯增多、腫大、相對(duì)壓痛閾值降低，而隨著急性炎癥的緩解(2周后)，炎癥因子含量回落，患處消腫，相對(duì)壓痛閾值回升，但OA進(jìn)程并未停止，軟骨損傷的深層病變隨OA進(jìn)程不斷加重，并從整體上反映為肢體步態(tài)變化.本文的炎癥、疼痛等相關(guān)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)可為骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制探討和OA治療藥物的藥理學(xué)評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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