萬(wàn)定榮，梅 青，盤 珊

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,武漢 430074；2武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430074)

木芙蓉葉系錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥葉，其性平味辛，具有涼血、解毒、消腫、止痛的功效，用于治療癰疽焮腫、纏身蛇丹、燙傷、目赤腫痛、跌打損傷[1].不同民族地區(qū)還將其分別用于治療偏頭痛、中耳炎(侗族)，肺癰咯血(畬族)，月經(jīng)過多、白帶(畬族、景頗族、傈僳族)，以及頸淋巴結(jié)核、闌尾炎(瑤族)；外用治腮腺炎(傈僳族、瑤族)[2].木芙蓉葉含黃酮苷、酚類、鞣質(zhì)、苯丙酸類及甾醇類化合物、揮發(fā)油類[3]等.其中，苯丙酸類化合物中的阿魏酸具有抗淋巴絲蟲的作用[4].木芙蓉葉醇提物具有良好的抑菌作用[5]，黃酮苷類化合物包括蘆丁(蕓香苷)、山柰酚-3-O-β-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-β-刺槐雙糖苷等是木芙蓉葉的主要活性成分，具有顯著的抗炎[6]、保肝[7]、抗腎缺血再灌注損傷[8,9]、抗糖尿病[10]等作用.文獻(xiàn)報(bào)道，新鮮木芙蓉葉經(jīng)低溫烘干處理后總黃酮含量最高[11]，但關(guān)于不同采收期樣品總黃酮的含量測(cè)定未見報(bào)道.筆者采用分光光度法對(duì)木芙蓉葉進(jìn)行了總黃酮含量測(cè)定的研究，比較分析了經(jīng)陰干處理的不同采收期的木芙蓉葉樣品總黃酮的含量，為木芙蓉葉的質(zhì)量控制及最佳采收期的確定提供了可靠依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材料

木芙蓉葉樣品共8批，其中7批采于中南民族大學(xué)校園內(nèi)，另1批購(gòu)于安徽亳州，均經(jīng)筆者鑒定為錦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的新鮮葉.采集后，陰干，備用.

表1 藥材樣品及其來源

1.2 儀器與試藥

UV-1800CP型紫外-可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,10080-200707)，無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加30％乙醇制成0.971mg/mL的對(duì)照品溶液.

2.2 供試品溶液的制備

經(jīng)過樣品提取條件的考察與選擇，確定供試品溶液的制備方法如下：將陰干的藥材樣品粉碎，過60目篩，取樣品粉末1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入30％的乙醇30 mL，稱定重量，加熱回流提取80 min，放冷，再次稱定重量，用30％乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻、靜置、濾過.精密量取續(xù)濾液5.0 mL,置10mL量瓶中，再用30％乙醇定容至刻度，搖勻即得.

2.3 顯色與測(cè)定方法

精密量取供試品溶液3.0 mL、對(duì)照品溶液適量，分別置25 mL容量瓶中，加5％ NaNO2溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，加10％ A1(NO3)31.0mL，混勻，放置6 min，加4％ NaOH 溶液10 mL，再用30％乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15min，并以相應(yīng)溶劑加入顯色劑的溶液作空白，在一定的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密量取對(duì)照品及供試品溶液各1.0mL，按“2.3”項(xiàng)下的操作方法，于400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別掃描(掃描間隔為1 nm)測(cè)定吸收光譜.結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液均在500 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收,故以500 nm為測(cè)定波長(zhǎng).

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照品溶液0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0 mL，分別置入25mL容量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的顯色及測(cè)定方法，于500nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度.以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度ρ(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：A=10.566ρ+0.0056 (r= 0.9999).結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品溶液在7.8～155.4 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系.

2.6 供試品溶液的制備方法

2.6.1 提取方法

取4號(hào)樣品粉末(過60目篩)1.0 g，共2份，分別精密稱定，各加50％乙醇30 mL，分別以回流、超聲處理2種方法提取40min，濾過，取續(xù)濾液制得供試液，按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算測(cè)得的樣品中的總黃酮的量.結(jié)果測(cè)得前者總黃酮的提取量是后者的1.73倍，說明相同條件下，回流提取法的提取效果遠(yuǎn)優(yōu)于超聲提取法.

2.6.2 提取溶劑

取4號(hào)樣品粉末(過60目篩)1.0 g，共7份，分別精密稱定，各加入20％,30％,40％,50％,60％,70％,95％ 的乙醇溶液30 mL，回流提取40 min，依“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試液，按“2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行顯色，定容溶劑為各濃度的乙醇溶液.并以各濃度的乙醇溶液加入顯色劑作空白，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品的總黃酮的量.結(jié)果表明：不同濃度的乙醇溶液所提取制備的供試液對(duì)吸光度值影響較大，用30％乙醇作提取溶劑提取的總黃酮的量最高.隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮苷的溶出量逐漸減少，而某些脂溶性雜質(zhì)溶出量隨之增加，從而干擾總黃酮的提取.

2.6.3 提取時(shí)間

取4號(hào)樣品粉末(過60目篩)1.0 g，共5份，精密稱定，分別加入30％乙醇溶液30 mL，各回流提取40,60,80,100,120 min，濾過，精密量取續(xù)濾液5.0 mL稀釋至10 mL，按“2.3”項(xiàng)下的顯色和測(cè)定方法，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算提得樣品的總黃酮的量.結(jié)果表明：木芙蓉葉樣品的最佳提取時(shí)間為80 min，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其總黃酮的量逐漸降低.可見提取時(shí)間長(zhǎng)短影響總黃酮量，時(shí)間過短黃酮類成分不能充分溶出，時(shí)間太長(zhǎng)部分對(duì)熱不穩(wěn)定的黃酮類成分分解損失，使總黃酮含量下降.

2.6.4 溶劑用量考察

取4號(hào)樣品粉末(過60目篩)1.0 g，共3份，分別精密稱定，固定乙醇濃度為30％，料液比(g/mL)分別為1︰10、1︰20、1︰30，回流提取80 min，濾過.分別精密量取續(xù)濾液5.0 mL稀釋至10 mL，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算出總黃酮的量.結(jié)果顯示，料液比從1︰20至1︰30過渡時(shí)，提取量?jī)H略有增加，考慮到實(shí)驗(yàn)成本，故料液比以1︰30為宜.

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取4號(hào)樣品粉末(過60目篩)1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液.精密量取供試品溶液3.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，于500 nm波長(zhǎng)處依法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，RSD為0.51％，表明本實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好.

2.7.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取4號(hào)樣品粉末(過60目篩)1.0g ，共6份，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液.精密量取供試品溶液3.0mL，置于25mL容量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分別計(jì)算6份樣品的總黃酮含量，并計(jì)算得RSD為2.03％，表明本方法重現(xiàn)性好.

2.7.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取4號(hào)樣品粉末(過60目篩)1.0g ，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液.精密量取供試品溶液3.0mL，置于25 mL容量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色.室溫放置0,1,2,4,8,12,24 h，均于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算出總黃酮含量，結(jié)果12 h內(nèi)的總黃酮含量的RSD為2.68％，表明供試品溶液顯色后在12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.7.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取適量已知含量的4號(hào)樣品溶液，共6份，分別加入相應(yīng)量的蘆丁對(duì)照品，依“2.3”項(xiàng)下的顯色及測(cè)定方法，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算得平均回收率為100.91％，RSD值為1.11％.結(jié)果見表2.

表2 加樣回收率結(jié)果

2.8 不同采收期樣品總黃酮含量測(cè)定

分別取8批木芙蓉葉樣品粉末(過60目篩)1.0 g，精密稱定，每批樣品平行取3份，分別按最佳提取方案(加入30％乙醇30 mL，回流80 min)提取，精密量取續(xù)濾液5.0 mL，置10 mL容量瓶中，用30％乙醇定容至刻度，搖勻，即得各批樣品的供試品溶液.按“2.3”項(xiàng)下的方法顯色，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算8批木芙蓉葉樣品(包括不同采收期收集的近枯萎的黃葉)的總黃酮含量.結(jié)果見表3，不同采收期樣品的總黃酮含量的變化規(guī)律如圖1.

表3 不同采收期藥材中總黃酮含量

圖1 不同采收期樣品的總黃酮含量的變化規(guī)律

3 討論

黃酮類化合物分別具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗病毒等作用.本研究采用分光光度法測(cè)定木芙蓉葉不同采收期樣品(包括近枯萎脫落的黃葉)的主要活性成分(總黃酮)的含量，以30倍量的30％乙醇溶液回流提取樣品80 min，以木芙蓉葉的主要活性成分之一蘆丁作為對(duì)照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定木芙蓉葉樣品溶液的吸光度.該含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可作為木芙蓉葉總黃酮的含量測(cè)定方法.

從6月中旬到12月中旬采自本校的4批成熟葉陰干樣品，其總黃酮含量隨采收期的推延而逐漸增加，并于12月中旬驟然達(dá)到最高；同采于本校的3批近脫落黃葉陰干樣品中的總黃酮含量也有這一變化規(guī)律；但同一采收期成熟葉的總黃酮含量普遍比近脫落黃葉略高.中國(guó)藥典2010年版(第一增補(bǔ)本)規(guī)定木芙蓉葉在“夏、秋二季采收”，綜合以上研究結(jié)果，筆者認(rèn)為該品以冬初采收成熟葉為宜.此外，葉片的總黃酮含量遠(yuǎn)高于葉柄，成熟葉的葉片含量是葉柄的5倍，近脫落黃葉的葉片的含量高出葉柄的10倍.此外，總黃酮含量的高低與木芙蓉葉樣品采摘時(shí)是否有嫩葉混雜有關(guān)，嫩葉的比例愈大，所測(cè)得總黃酮的含量愈低.10月中旬購(gòu)自安徽亳州的木芙蓉葉樣品的總黃酮含量明顯低于采自本校的樣品，說明產(chǎn)地和藥材部位也是影響總黃酮含量的重要因素.

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