楊莉　歐都　齊亞銀　張莉

摘要：為了研究寒冷應(yīng)激對(duì)阿勒泰羊脂肪酸合成酶 mRNA表達(dá)的影響，在寒冷應(yīng)激前后分別采集湖羊及阿勒泰羊各個(gè)部位的組織，采用RT-PCR方法檢測(cè)各組織中肪肪酸合成酶（Fas） mRNA表達(dá)水平，分析在不同品種、不同部位寒冷應(yīng)激后其表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，阿勒泰羊及湖羊Fas mRNA表達(dá)量在應(yīng)激后均有下降，阿勒泰羊尤為顯著，且應(yīng)激后尾部和頸部冷表達(dá)量最低。研究表明，在寒冷應(yīng)激下脂肪酸合成減少，脂肪作為能源物質(zhì)被分解供能并維持體溫的恒定，以適應(yīng)冷刺激。

關(guān)鍵詞：寒冷應(yīng)激；脂肪酸合成酶；阿勒泰羊；湖羊；mRNA表達(dá)水平

中圖分類號(hào)： S826.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0028-03

應(yīng)激于1936年由加拿大病理生理學(xué)家 Selye首次提出，并定義為機(jī)體對(duì)外界或內(nèi)部的各種異常刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和。對(duì)動(dòng)物而言，環(huán)境的冷熱、創(chuàng)傷、驚嚇都屬于應(yīng)激刺激。不同的應(yīng)激源產(chǎn)生的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制和機(jī)體所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)不同。而冷應(yīng)激是高寒地區(qū)最普遍的應(yīng)激源之一，新疆阿勒泰地區(qū)位于中國(guó)西北邊陲，冬季長(zhǎng)達(dá)半年，溫度最低可達(dá)-40 ℃，四季不分明，只有冷暖差別。許多優(yōu)良綿羊品種無(wú)法適應(yīng)阿勒泰地區(qū)異常寒冷的氣候條件，而阿勒泰羊以其抗寒性強(qiáng)、耐粗飼等特點(diǎn)，成為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)良類群[1]。

肪肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)as）是脂肪合成的關(guān)鍵酶之一，它參與長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的一系列反應(yīng)，最后生成棕?cái)R酸。動(dòng)物機(jī)體中脂肪合成和沉積所需的脂肪酸大部分都來(lái)源于脂肪酸的從頭合成，即乙酰輔酶A（CoA）和丙二酸單酰CoA在Fas的催化下合成脂肪酸的過(guò)程，進(jìn)而脂肪酸與甘油合成甘油三脂，F(xiàn)as在機(jī)體組織中的表達(dá)量和酶的活性對(duì)脂肪酸的合成和脂肪的沉積具有決定性作用[2-3]。

新疆阿勒泰羊全身肌肉豐滿肥碩，尾根附近沉積大量脂肪，能夠適應(yīng)阿勒泰地區(qū)異常寒冷的氣候條件。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究證實(shí)，阿勒泰羊的脂肪酸代謝對(duì)體溫降低的適應(yīng)很敏感，為了研究其脂肪組織在抗寒中的重要性，確定其在寒冷的環(huán)境下是否作為主要的能源物質(zhì)參與產(chǎn)熱以維持溫度的恒定，本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)寒冷應(yīng)激前后阿勒泰羊和湖羊各部位脂肪組織Fas mRNA 的表達(dá)量，旨在從低溫對(duì)不同品種綿羊脂肪組織的合成方面分析阿勒泰羊耐寒的可能適應(yīng)機(jī)制，為新疆綿羊抗寒育種工作提供理論依據(jù)，減少寒冷應(yīng)激對(duì)養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)的損失。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

選擇新疆福?？h健康成年的阿勒泰羊和湖羊各5只，在寒冷應(yīng)激前（10月）和寒冷應(yīng)激后（1月）分別采集湖羊及阿勒泰羊頸部肌間脂肪、胸部肌間脂肪、腹部肌間脂肪、腿部肌間脂肪、尾部脂肪以及肝臟等6個(gè)部位的組織，立即放入液氮罐速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

Trizol、DEPC、DNA Marker、mix、質(zhì)粒提取試劑盒（批號(hào)：DP103-02）購(gòu)自天根生物科技服務(wù)有限公司；PrimeScriptRT reagent kit反轉(zhuǎn)試劑盒（批號(hào)：RR047A）、pMD18-T Simple Vector、SYBR Premix Ex TaqTM kit試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司（批號(hào)：DRR420A）；DNA凝膠回收試劑盒（批號(hào)：DP209-02）；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、瓊脂糖、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇購(gòu)自北京華美生物工程公司；感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)布的綿羊Fas基因?yàn)槟０妫ǖ卿浱?hào)：AF479289.1）用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因有限公司合成。上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′，目的片段長(zhǎng)度為256 bp。

1.2.2 RNA的提取 利用TRIZOL一步法提取試驗(yàn)樣品的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，-70 ℃保存?zhèn)溆?。然后依次加入以下試劑：RNA 1 μg，10× Reaction buffer 2 μL，MgCl2 1 μL，DNase Ⅰ-RNase-free 1 μL，DEPC處理水補(bǔ)足10 μL，除去存在的少量基因組 DNA。37 ℃反應(yīng) 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃ 孵化10 min，即可用此RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板。以RNase-free水為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260 nm/D280 nm的值和總RNA濃度。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 向提取純化好的各組織總RNA中加入以下試劑：5× gDNA Eraser bufferⅠ2 μL，5× gDNA EraserⅠ1 μL，總RNA 1 μL，無(wú)核酸酶水補(bǔ)足至10 μL。42 ℃孵育混合物3 min，冷卻后，向下旋轉(zhuǎn)混勻，將管子放回冰上。再向以上反應(yīng)液中按指定順序加入如下試劑：無(wú)核酸酶水Ⅰ4 μL，5×prime sclipt buffer 2 4 μL，RT Prime MixⅠ1 μL，prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL，終體積為20 μL。加完樣后輕柔混合，短暫離心后37 ℃孵育混合物30 min，最后85 ℃加熱5 s 終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR擴(kuò)增，或于-20℃下保存（

1.2.4 目的基因PCR反應(yīng)及克隆測(cè)序 利用常規(guī)PCR反應(yīng)對(duì)組織樣品中Fas基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：Taq DNA聚合酶1.5 μL，10 pmol/L上下游引物各1 μL，10×緩沖液（含Mg2+） 2 μL，2.5 μmol/L dNTP 2 μL，cDNA 2 μL，超純水補(bǔ)足到20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。利用常規(guī)PCR反應(yīng)對(duì)組織樣品中Fas基因進(jìn)行擴(kuò)增，將目標(biāo)片段分別從瓊脂糖凝膠中切下，按照DNA回收試劑盒說(shuō)明回收目標(biāo)片段，在T4 DNA連接酶作用下，經(jīng)16 ℃過(guò)夜連接pMD18-T載體，用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌落后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，然后從菌液中提取質(zhì)粒，菌液送往上海華大基因公司測(cè)序。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) 提取重組質(zhì)粒pMD18-T-Fas，將線性化純化后質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260 nm、D280 nm，按下式計(jì)算拷貝數(shù)：

拷貝數(shù)（拷貝/mL）=（質(zhì)粒濃度×6.02×1023）/（649×重組質(zhì)粒長(zhǎng)度）。

式中：6.02×1023為阿氏常數(shù)；649為質(zhì)粒分子質(zhì)量為1個(gè)堿基的平均分子質(zhì)量。

將重組質(zhì)粒濃度稀釋為1010拷貝數(shù)后，在依次稀釋為 108、107、106、105、104、103、102、10，以不同濃度的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR 10 μL，ddH2O 7.2 μL，10 pmol/L上下游引物各0.4 μL，模板 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，50個(gè)循環(huán)。

反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算機(jī)自身會(huì)根據(jù)質(zhì)粒濃度與cDNA模板的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)此標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算質(zhì)粒濃度。應(yīng)用MX3000P熒光定量PCR儀進(jìn)行表達(dá)分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)阿勒泰羊和湖羊的Fas mRNA表達(dá)量 對(duì)寒冷應(yīng)激前后阿勒泰羊及湖羊的頸部肌間脂肪、胸部肌間脂肪、腹部肌間脂肪、腿部肌間脂肪、尾部脂肪和肝臟組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)組織進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所測(cè)不同樣本的質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)，用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，用t檢驗(yàn)確定Fas基因的表達(dá)量，根據(jù)單因素方差分析寒冷應(yīng)激前后與物種間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取總RNA

總RNA的質(zhì)量是獲得完整cDNA序列的關(guān)鍵因素。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA，28S和18S RNA帶型清晰可見，表明總RNA無(wú)降解，完整性較好（圖1）。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定后D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA無(wú)蛋白質(zhì)和苯酚污染，純度較高，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 Fas基因的RT-RCR擴(kuò)增

提取湖羊和阿勒泰羊各組織的RNA，采用分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行定量并調(diào)整至相同劑量。以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以Fas的上、下游引物擴(kuò)增，得到256 bp的條帶（圖2）?？梢钥闯?，各組織的PCR擴(kuò)增條帶亮度基本一致，說(shuō)明各個(gè)組織的cDNA模板擴(kuò)增穩(wěn)定。

2.3 Fas基因的mRNA組織表達(dá)水平的絕對(duì)定量分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成 LightCycle根據(jù)所測(cè)的質(zhì)粒濃度自動(dòng)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3至圖5），測(cè)得Fas基因的值幾乎在一條直線上，相關(guān)系數(shù)是0.998 6，曲線的斜率為-3.274，F(xiàn)as基因的擴(kuò)增效率為E=10-1/-3.27-1=1.02，而擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線出現(xiàn)了1個(gè)主峰，Tm值為（92±0.2）℃；說(shuō)明所建立的綿羊Fas mRNA定量檢測(cè)方法是有效的。

2.4 阿勒泰羊與湖羊在應(yīng)激前與應(yīng)激后Fas mRNA在不同組織中的表達(dá)量分析

阿勒泰羊在應(yīng)激后各個(gè)部位組織的Fas mRNA表達(dá)量均有下降，其中阿勒泰羊的頸部、胸部、腹部、腿部肌間脂肪及尾部脂肪的表達(dá)量與應(yīng)激前差異極顯著（P<0.01）（圖6）。

湖羊在應(yīng)激后各個(gè)組織的Fas mRNA表達(dá)量均有下降，其中頸部肌間脂肪、 胸部肌間脂肪、腿部肌間脂肪Fas mRNA

表達(dá)量與應(yīng)激前相比差異顯著（P0.05）（圖6）。

阿勒泰羊各組織在應(yīng)激前的Fas mRNA表達(dá)量均高于湖羊，而兩者在應(yīng)激后頸部、胸部、腿部肌間脂肪的表達(dá)量差異不顯著，腹部肌間脂肪和尾部脂肪相比差異顯著（P

3 結(jié)論與討論

機(jī)體通過(guò)協(xié)調(diào)控制有關(guān)脂肪合成和分解的酶的活性和基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)體脂的沉積，使動(dòng)物體脂的沉積始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，F(xiàn)as是體組織脂肪酸再生能力的主要限速酶，在動(dòng)物體脂沉積中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平的升高能夠顯著增加甘油三酯在體內(nèi)的沉積[4]。脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，Lpl）是脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶[5]，對(duì)脂肪沉積具有反作用，主要功能是水解極低密度脂蛋白（VLDL）和乳糜微粒（CM）中的甘油三酯（TG），使之轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿恿康闹舅?，以供各種組織貯存和利用。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)寒冷應(yīng)激前后阿勒泰羊和湖羊不同組織Fas mRNA的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各組織的Fas的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；同時(shí)，本試驗(yàn)前期研究得出寒冷應(yīng)激后Lpl在阿勒泰羊和湖羊各組織的表達(dá)量均顯著升高，其結(jié)果可在一定程度上反映機(jī)體脂質(zhì)代謝的規(guī)律，在寒冷應(yīng)激前Fas表達(dá)量較高，促進(jìn)脂肪沉積；Lpl的表達(dá)量較低，阻止了脂肪酸進(jìn)入脂肪組織沉積，脂肪組織把多余的能量轉(zhuǎn)變成脂肪儲(chǔ)存起來(lái)。而寒冷應(yīng)激后Fas和Lpl表達(dá)量與寒冷應(yīng)激前相反，機(jī)體分解脂肪用以供能并維持體溫的恒定。

多數(shù)研究表明，熱應(yīng)激可以增加脂肪沉積的趨勢(shì)[6-7]，動(dòng)物的體脂沉積所需要的脂肪酸大多來(lái)自脂肪酸的全程合成[3]。劉梅等研究了急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞Fas mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)急性熱應(yīng)激顯著增加了肝臟Fas mRNA相對(duì)表達(dá)水平，從而促進(jìn)了肝臟的脂肪酸合成，同時(shí)急性熱應(yīng)激對(duì)腹脂F(xiàn)as表達(dá)量影響并不顯著[8]。其結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相反，應(yīng)激源的相對(duì)性和不同物種之間脂肪代謝的調(diào)節(jié)機(jī)理也不一致。對(duì)于寒冷應(yīng)激對(duì)脂肪代謝的研究較少，由本試驗(yàn)結(jié)果可推斷，在寒冷應(yīng)激下脂肪酸合成減少，脂肪作為能源物質(zhì)被分解供能，來(lái)適應(yīng)冷刺激。同時(shí)，仔雞的肝臟是胴體脂肪酸合成的主要場(chǎng)所，90%胴體脂肪在肝臟中合成[9-11]，而綿羊的脂肪組織是胴體脂肪合成的唯一場(chǎng)所，因此阿勒泰羊與湖羊肝臟Fas mRNA表達(dá)量比脂肪組織低。

本試驗(yàn)選用新疆耐寒品種阿勒泰羊和不耐寒品種湖羊作為試驗(yàn)對(duì)象，全面系統(tǒng)地研究了低溫條件下2種綿羊機(jī)體內(nèi)脂肪組織參與能量代謝的變化過(guò)程，比較其脂肪酸合成酶和脂蛋白脂酶在不同品種之間的表達(dá)差異，揭示了阿勒泰羊耐寒的可能適應(yīng)機(jī)制，為新疆綿羊抗寒育種工作提供理論依據(jù)。

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