馮 波，林元山，胡 超，劉 婷

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，b.東方科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國長沙 410128)

木質(zhì)素是一類由苯基丙烷單元通過醚鍵和碳碳鍵等連接而成的聚酚類三維網(wǎng)狀高分子化合物，極難被降解，在植物細(xì)胞壁中與半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，包埋住纖維素分子，構(gòu)成更加復(fù)雜的聚合物，阻礙了對(duì)植物纖維素材料等可再生資源的有效利用［1］.自然界能夠降解木質(zhì)素的微生物主要分為白腐菌、褐腐菌和軟腐菌.其中，白腐菌的酶系較完全、酶活較高，其不僅能分泌木質(zhì)素降解酶，同時(shí)還分泌纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等［2］.木質(zhì)素降解酶系中起主導(dǎo)作用的酶有3 種，即漆酶(Laccase，Lac)、木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin Peroxidase，LiP)、錳過氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)［3］.其中漆酶由于存在的廣泛性、催化底物的多樣性以及酶活、穩(wěn)定性都相對(duì)較高而得到廣泛的研究與應(yīng)用［4］.漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，主要產(chǎn)酶菌株為擔(dān)子菌(Basidimycetes)，如黃孢原毛平革菌(Phanerchaeto chrysosporium)、毛栓菌(Trametes hirsuta)、長絨毛栓菌(Trametes villosa)、脈射菌(Phlebia radiata)、鳳尾菇(Pleuortus pulmonanus)等［5-7］.漆酶能夠催化多種底物氧化水解，廣泛用于染料脫色，紙漿漂白，有機(jī)污染物降解，飲料澄清與色澤控制，藥物制備以及新材料、生物傳感器、生物監(jiān)測等領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用［8-10］.目前，野生型菌株的木質(zhì)素降解能力和漆酶活力普遍不高，因此，篩選漆酶高產(chǎn)野生型菌株具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 試驗(yàn)篩選樣品來源于從岳麓山、瀏陽河等地采集的腐土和朽木.

1.1.2 試劑 ABTS 購于Sigma 公司;其余分析純和化學(xué)純藥劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;土豆、麩皮、豆餅粉、稻草粉等購于當(dāng)?shù)厥袌?

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)篩選培養(yǎng)基為愈創(chuàng)木酚-PDA 固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L，愈創(chuàng)木酚0.4 g/L，微量VB1，pH 自然.

(2)苯胺藍(lán)(Azure-B)固體培養(yǎng)基:馬鈴薯汁200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L，8 μmol/L Azure-B，微量VB1，pH 自然.

(3)搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，麩皮20 g/L，pH 自然.

(4)種子培養(yǎng)基:麩皮汁50 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 自然.

(5)液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，硫酸銨5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CuSO4·5H2O 0.05 g/L，MnSO40.05 g/L，pH 自然.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木質(zhì)素酶產(chǎn)生菌株的篩選 稱取樣品材料10 g，搗碎后加入裝有90 mL 無菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，振蕩30 min 后靜置，按10 倍稀釋法涂布0.2 mL 于愈創(chuàng)木酚-PDA 平板上，30 ℃培養(yǎng)至菌落長出.觀察菌落顏色和形狀的變化，并分別測定其菌落圈和變色圈的直徑，計(jì)算其變色系數(shù)(菌落圈半徑d1/變色圈半徑d2).挑取單菌落純化至Azure-B 培養(yǎng)基平板中央，30 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株是否產(chǎn)生脫色圈.

1.2.2 菌種鑒定 觀察PDA 培養(yǎng)基與液體搖瓶培養(yǎng)基中的菌體形態(tài)特征;并于顯微鏡下拍照記錄;菌種送北京三博遠(yuǎn)志生物科技公司測序，并通過BLAST 與GenBank 中的序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行鑒定.1.2.3 種子液的制備 挑取活化后的菌種接入裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在30 ℃，150 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3 d，制得種子液.

1.2.4 液體搖瓶發(fā)酵及粗酶液的制備 取2 mL 種子液接入裝有100 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃，150 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3～7 d.發(fā)酵液用四層紗布過濾，濾液在12 000×g 條件下離心5 min，上清即為粗酶液.

1.2.5 酶活力的測定 采用ABTS 法［6，11］:取0.1 mol/L pH3.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液1.95 mL 和0.5 mmol/L ABTS(2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸))2.00 mL，置于30 ℃水浴10 min 后，加入0.05 mL 酶液啟動(dòng)反應(yīng)，以滅活的酶液作空白對(duì)照，測定反應(yīng)前5 min 內(nèi)420 nm 處吸光度的增加值ΔOD420.定義每分鐘氧化1 μmol ABTS 所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位(U).計(jì)算公式為:酶活力(U/L)=ΔOD420×V總×106/(ε×Δt×V酶)，式中ε 為ABTS 氧化態(tài)的摩爾消光系數(shù)(36 000 L·mol－1·cm－1)，Δt 為反應(yīng)時(shí)間.

2 結(jié)果與分析

2.1 愈創(chuàng)木酚-PDA 平板初篩及Azure-B 平板定性檢測

本試驗(yàn)通過愈創(chuàng)木酚-PDA 培養(yǎng)基平板的初篩，經(jīng)分離純化后共獲得約110 株菌.菌株均能在愈創(chuàng)木酚-PDA 平板上產(chǎn)生褐色變色圈，說明有產(chǎn)生木質(zhì)素酶的能力;部分菌株相關(guān)數(shù)據(jù)見表1，變色系數(shù)越大，相對(duì)菌落的木質(zhì)素酶活力越小.從表1 中可知，菌株Lys2833 變色系數(shù)為0.43，菌落木質(zhì)素酶的活力相對(duì)較大，但菌落較小，酶活力總量不大;菌株Lys2988 的變色系數(shù)為1.37，木質(zhì)素酶的活力相對(duì)較小，但菌落較大，生長較好，其優(yōu)先降解纖維素;菌株Lys3002 變色系數(shù)為0.65，木質(zhì)素酶的活力較大，且菌落最大，生長良好，酶活力及酶總量最大，進(jìn)一步經(jīng)愈創(chuàng)木酚平板定性檢測發(fā)現(xiàn)，該菌變色圈顏色最深，為紅褐色(圖1a，彩圖見封三)，且該菌能夠分泌木質(zhì)素過氧化物酶氧化培養(yǎng)基中藍(lán)色的Azure-B 而出現(xiàn)脫色圈(圖1b，彩圖見封三)，顯示出菌株Lys3002 具有分泌木質(zhì)素酶系的能力，并且其中漆酶活力較高，因此選擇該菌株進(jìn)行下一步深入研究.

表1 菌株在愈創(chuàng)木酚平板上的生長及顯色反應(yīng)Tab.1 The color reaction of different strains on culture media contained guaiacol

圖1 菌株Lys3002 平板顯色及顯微觀察Fig.1 Coloration of the strain Lys3002 on media and microscopic observation

2.2 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

根據(jù)愈創(chuàng)木酚-PDA 平板初篩及Azure-B 平板定性檢測結(jié)果對(duì)菌株Lys3002 進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定3～7 d 內(nèi)漆酶活力的大小(見圖2).從圖2 可知該菌株第5 天木質(zhì)素酶系中漆酶活力達(dá)到最高449.6 U/L，之后有所減少，因此菌株Lys3002 的最佳發(fā)酵周期為5 d.

2.3 菌株Lys3002 的鑒定

菌株Lys3002 在PDA 平板上的菌落形態(tài)呈白色圓形，菌絲為致密的短絨狀，緊貼平板生長，前期生長較慢，2～3 d 后有菌絲長出，此后生長較快，4～5 d 可長滿整個(gè)平板;該菌的顯微鏡形態(tài)見圖1，菌絲細(xì)長，有較多分支(圖1c)，孢子呈柱狀或球狀(圖1d)，菌絲有隔膜(圖1e，箭頭所示)，可觀察到鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)(圖1f);在4 ℃冰箱長期斜面保存，偶有黃棕色小子實(shí)體長出;在液體搖瓶培養(yǎng)基中可形成白色絨狀的圓形菌絲球.經(jīng)北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，其ITS 序列已提交GenBank 數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為KJ840830;該序列與庫中已知的真菌序列BLAST 檢索比對(duì)，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3).從圖3可知，菌株Lys3002 與毛栓菌親緣最近，ITS 序列的同源度達(dá)99%以上，結(jié)合形態(tài)分析，該菌株鑒定為毛栓菌(Trametes hirsuta).

圖2 菌株Lys3002 發(fā)酵產(chǎn)漆酶曲線Fig.2 Curve of laccase production by strain Lys3002

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 碳源的影響 分別選取20 g/L 葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、稻草粉為碳源，5 g/L 硫酸銨為氮源的液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d 后分別測定漆酶活力.從圖4 可知，總體酶活力不高，處于150～210 U/L之間，可能與硫酸銨作為氮源的影響有關(guān).但麩皮為碳源時(shí)，酶活力達(dá)到206.7 U/L，與其他的碳源差異顯著(P ＜0.05)，因此確定麩皮為菌株Lys3002 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源.

圖3 菌株Lys3002 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain Lys3002

2.4.2 氮源的影響 分別選取5 g/L 硫酸銨、尿素、豆餅粉、蛋白胨、牛肉膏為氮源，20 g/L 麩皮為碳源的液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d 后分別測定漆酶活力.從圖5 可知，不同氮源對(duì)漆酶的影響差異顯著(P ＜0.05)，有機(jī)氮源豆餅粉、蛋白胨、牛肉膏的酶活力較高，其中豆餅粉酶活力最大，達(dá)到480.0 U/L，因此確定豆餅粉為菌株Lys3002 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源.

圖4 碳源對(duì)菌株Lys3002 產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of carbon sources on laccase production by strain Lys3002

圖5 氮源對(duì)菌株Lys3002 產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on laccase production by strain Lys3002

2.4.3 培養(yǎng)基起始pH 的影響 以碳源(20 g/L 麩皮)、氮源(5 g/L 豆餅粉)優(yōu)化后的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)初始pH 為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，接種菌株Lys3002 種子液后培養(yǎng)5 d.從圖6 可知，在pH 4.0～7.0 范圍內(nèi)，菌體生長良好，說明菌株Lys3002 有較寬的pH 適應(yīng)范圍.培養(yǎng)基初始pH 在5.0～6.0 范圍內(nèi)酶活力無顯著差異，漆酶活力達(dá)500 U/L 以上.由于在自然條件下此培養(yǎng)基pH 值為5.6～6.0，滅菌后略有下降，因此菌株Lys3002 在進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵時(shí)無需控制其pH 值.

2.4.4 培養(yǎng)基中金屬離子的影響 研究表明［8］，微生物液態(tài)發(fā)酵分泌漆酶的過程中，培養(yǎng)基中的金屬離子對(duì)產(chǎn)酶具有重要影響.因此本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了Cu2+，Mn2+和Mg2+對(duì)菌株Lys3002 發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響，從圖7 可知，培養(yǎng)基中添加Cu2+、Mn2+、Mg2+時(shí)漆酶活力最大，達(dá)479.3 U/L，說明Cu2+，Mn2+和Mg2+對(duì)漆酶活力均有促進(jìn)作用，Mg2+的促進(jìn)作用較Cu2+和Mn2+更為明顯，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致.

圖6 pH 條件對(duì)菌株Lys3002 產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of pH value on laccase production by strain Lys3002

2.4.5 正交試驗(yàn)分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)產(chǎn)酶影響較大的4 個(gè)因素(麩皮、豆餅粉、Mg2+、溫度)進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn).從表2 可知:通過9 組發(fā)酵條件組合進(jìn)行試驗(yàn)，酶活力得到較大提高，最高達(dá)到591.11 U/L;從R 值的大小RA＞RC＞RD＞RB可以看出影響因素由強(qiáng)到弱依次為麩皮、Mg2+、溫度、豆餅粉;從K 值分析可得出最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C3D2，即麩皮20 g/L，豆餅粉6 g/L，Mg2+0.5 g/L，溫度30 ℃.經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證，培養(yǎng)基配方為麩皮20 g/L，豆餅粉6 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO40.05 g/L，CuSO4·5H2O 0.05 g/L，培養(yǎng)基初始pH 自然，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵周期5 d，酶活力可達(dá)597.82 U/L.

圖7 金屬離子對(duì)菌株Lys3002 產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of metal ions on laccase production by strain Lys3002

表2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.2 The analysis of the orthogonal for the fermentation conditions

3 結(jié)果與討論

大量研究表明，白腐菌是目前已知的自然界中降解木質(zhì)素能力最強(qiáng)的一類真菌［1］.本研究先后設(shè)計(jì)含有愈創(chuàng)木酚和Azure-B 的初篩培養(yǎng)基、搖瓶復(fù)篩等多重篩選，獲得了一株降解木質(zhì)素能力較高的白腐真菌Lys3002，經(jīng)鑒定該菌為毛栓菌(Trametes hirsuta).采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，進(jìn)一步研究了菌株Lys3002液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的最佳條件，結(jié)果表明:碳源和氮源的種類及濃度對(duì)產(chǎn)酶具有較大影響，國內(nèi)外很多學(xué)者利用不同的無機(jī)、有機(jī)或復(fù)合的碳源和氮源來研究微生物的產(chǎn)漆酶能力，林娟等［6］研究表明，漆酶在最佳氮源為酒石酸銨的高氮低碳培養(yǎng)基中活力較高，而本研究中菌株Lys3002 在有機(jī)氮培養(yǎng)基中的漆酶活力明顯高于無機(jī)氮培養(yǎng)基中的酶活，這與杜海英等［12］報(bào)道的一株白腐真菌液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的氮源條件較為一致;菌株Lys3002 在pH 4.0～7.0，28～32 ℃范圍內(nèi)生長良好，在pH 5.0～6.0，30 ℃條件下產(chǎn)漆酶活力較高;漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，Cu2+對(duì)漆酶的產(chǎn)生有一定的誘導(dǎo)作用，因此在培養(yǎng)基中添加一定量的Cu2+，Mn2+和Mg2+等微量元素可提高漆酶產(chǎn)量;最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮2.0%，豆餅粉0.6%，MgSO4·7H2O 0.05%，CuSO4·5H2O 0.005%，MnSO40.005%，發(fā)酵5 d 漆酶活力高達(dá)597.82 U/L，高于燕紅等［13］報(bào)道的木質(zhì)素降解菌的漆酶活力144 U/L.作為一株原始野生菌，該菌株產(chǎn)酶能力很可觀，有望進(jìn)一步通過誘變育種或基因改良，獲得產(chǎn)酶能力更高的突變菌株或基因工程菌，具有一定的應(yīng)用潛力.

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