周 田，戴林建，楊 蘇，陳 武，鄧 杰 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南長沙410128)

煙草花藥培養(yǎng)是指改變花粉的發(fā)育程序，使其分裂形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而分化成胚狀體，產(chǎn)生再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株的一個過程［1］。鉀高效烤煙雜交品種是經(jīng)多年試種而形成的富鉀煙葉品種，但經(jīng)多年的觀察種植發(fā)現(xiàn)其常年發(fā)病，范圍廣，程度深。為尋求抗病優(yōu)質(zhì)烤煙，花藥培養(yǎng)在國際上取得巨大進(jìn)步，從第1次毛蔓陀羅花藥培養(yǎng)取得的成功開始［2］，很多國家相繼進(jìn)行了花藥培養(yǎng)方面的研究工作，使該技術(shù)在育種工作中不斷走向成熟，其可迅速獲得純合型材料，獲得育種中間材料，縮短育種年限，大大加快了育種速度，節(jié)省了大量的人力、物力。除此之外，還可作為遺傳工程受體［3］。鑒于此，筆者以3個鉀高效烤煙雜交品種為試驗材料進(jìn)行了花藥培養(yǎng)，以期為實現(xiàn)既富含鉀又具穩(wěn)定抗病性的優(yōu)勢煙葉提供借鑒。

1 材料與方法

1．1 材料 云87×GK3、K326×GK3、G80×GK5品種均由中南煙草試驗站提供。

1．2 方法

1．2．1 花藥預(yù)處理。晴天在田間采摘花粉正處單核靠邊期(花萼與花冠等長)的花蕊，放入5～7℃冰箱內(nèi)低溫預(yù)處理，處理時間為1～3 d。

1．2．2 花藥消毒。取適量花蕊在一定大小容器中用無菌水沖洗2次，再用75%乙醇漂洗30 s，接著無菌水沖洗2次，而后用20%次氯酸鈉滅菌15 min，過后無菌水沖洗4次，置于無菌濾紙上除濕。

1．2．3 培養(yǎng)基制備。試驗直接采用市場上人工合成的MS培養(yǎng)基，具體為1/2MS+20 g蔗糖+1 000 ml水+7 g瓊脂，滅菌冷卻至50℃左右后加入激素0．80 g/L 6-BA和0．16 g/L IAA，pH 5．8。生根培養(yǎng)基無需加激素類，將蔗糖量調(diào)為30 g和pH調(diào)為6．0即可。

1．2．4 花藥接種與培養(yǎng)。在25℃、每天光照12 h的培養(yǎng)條件下剝?nèi)∠具^的花藥置于培養(yǎng)基中，觀察記錄各時期花藥特征。待花藥萌發(fā)出苗后，計算出苗率并將其進(jìn)行分株，明確煙苗株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同煙草雜交品種花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)頻率差異 用1/2MS的培養(yǎng)基進(jìn)行不同煙草雜交品種的花藥培養(yǎng)，試驗共接種3個品種，分別是云87×GK3、K326×GK3、G80×GK5，均為高鉀雜交種，所有品種均培養(yǎng)出苗，但花藥萌發(fā)率卻存在差異。由表1可知，云87×GK3的萌發(fā)率最高，K326×GK3次之，G80×GK5最低。云87×GK3的花藥萌發(fā)率為9．6%，接近于K326×GK3的花藥萌發(fā)率(9．1%)，而G80×GK5的萌發(fā)率卻只有4．0%，與前兩者存在較大差異。這可能與雜交品種的不同有關(guān)，前2個雜交品種均是與GK3雜交，而后者是與GK5雜交，且雜交原種也各不相同，這可能是導(dǎo)致各品種萌發(fā)率不同以及前兩者與后者萌發(fā)率相差大的原因。

表1 不同煙草雜交品種花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率差異

2．2 不同煙草雜交品種的單個花藥培養(yǎng)成苗株數(shù)差異 供試的3個高鉀雜交品種均處在相同培養(yǎng)基、同一溫度等條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，所有萌發(fā)的花藥均由愈傷組織或胚狀體發(fā)育成正常煙苗，但單個花藥的出苗株數(shù)卻各不相同。由表2可知，云87×GK3的已萌發(fā)的花藥中，平均每個花藥可長出6株左右煙苗，而 K326×GK3和G80×GK5卻只有2．38和2．00株，明顯低于云87×GK3。究其原因，可能是因為品種基因型不同，品種不同，花藥中的花粉的抗逆性就有強(qiáng)有弱，由胚狀體長成植株的數(shù)目也就有多有少，這種隨機(jī)性是無可預(yù)估的，同時還存在試驗中因細(xì)菌感染或光照問題產(chǎn)生畸形苗而使少量植株中途死亡，致使苗數(shù)減少而產(chǎn)生試驗誤差。

表2 不同煙草雜交品種花藥培養(yǎng)成苗株數(shù)差異

2．3 低溫預(yù)處理時間和溫光條件對煙草花藥培養(yǎng)的影響 試驗的花藥預(yù)處理時間為1～3 d，在培養(yǎng)過程中如花藥處理時間在2 d內(nèi)，消毒則會正常進(jìn)行，若超過2 d甚至3 d，花藥消毒過程中則會嚴(yán)重傷到花萼和花冠，甚至感染到花藥。這可能與花蕊的保鮮性有關(guān)，致使花蕾失活萎蔫失去對花藥的保護(hù)能力。所以花藥最適處理時間為1～2 d。

花藥接種在培養(yǎng)基后，移至25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照12 h，超過3 d左右，花藥由嫩綠色變?yōu)榈S色，接著又變?yōu)辄S褐、褐色，花藥體積不斷膨脹，10～15 d花藥裂開并伴隨乳白色胚狀體的出現(xiàn)，并逐漸發(fā)育成小植株。但也不全是按照上述理論時間段來發(fā)展，有的花藥長達(dá)3個月以上才形成小植株。若花藥培養(yǎng)溫度在20℃以下，花藥不僅難以萌發(fā)，萌發(fā)出的煙苗也難以成活，且在光照不足的情況下還易形成白化苗、玻璃苗等，影響花藥培養(yǎng)的成效。

3 結(jié)論與討論

隨著現(xiàn)代生物科技的進(jìn)步，煙草花藥培養(yǎng)技術(shù)已獲得穩(wěn)定的發(fā)展，尤其是常規(guī)烤煙品種花藥培養(yǎng)。而目前烤煙面臨的大面積病害與煙葉質(zhì)量惡劣等問題迫使人們?yōu)楂@得既抗病又優(yōu)質(zhì)的煙葉而不斷探索更加簡捷有效的方針。該試驗利用高鉀雜交品種進(jìn)行煙草花藥培養(yǎng)，結(jié)果表明，3個雜交品種的煙草花藥均能萌發(fā)出胚狀體并長出正常植株，盡管伴隨著個體差異，但正因為這些差異才體現(xiàn)出品種間的特異性。

在不同品種花藥萌發(fā)誘導(dǎo)率的對比中，云87×GK3和K326×GK3的萌發(fā)率趨于相近，明顯高于G80×GK5，這可能與GK3和GK5品種間的差異有關(guān)。有研究表明單倍體培養(yǎng)的胚產(chǎn)量和質(zhì)量是由基因型決定的，是影響單倍體培養(yǎng)的主要因素［4］。而在后來的單個花藥培養(yǎng)成苗株數(shù)的對比中，各個品種依然存在差異，其差異趨勢又與花藥萌發(fā)誘導(dǎo)率截然不同，沒有明顯的規(guī)律，該現(xiàn)象不能單單追溯品種的基因問題，更與試驗過程中操作不當(dāng)造成花藥感染失活產(chǎn)生的誤差有關(guān)。

通過近幾年的發(fā)展可以看出，煙草花藥培養(yǎng)必將在煙草遺傳育種研究中占據(jù)不可替代的地位，但是煙草花藥培養(yǎng)技術(shù)有待改善和提高。應(yīng)充分了解花藥培養(yǎng)過程中的有利因素，如花藥培養(yǎng)的最適時期［5］、預(yù)處理溫度與時間［6］、激素的種類及適當(dāng)?shù)臐舛扰浔龋?］、培養(yǎng)基添加活性炭效應(yīng)［8］、接種植株的生長環(huán)境控制等對花藥培養(yǎng)效果的影響，提高胚狀體的誘導(dǎo)頻率。此外，花藥培養(yǎng)出的純系品種在后代中可能表現(xiàn)出基因的不穩(wěn)定性，使品種發(fā)生變異，因此，應(yīng)結(jié)合花藥培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)來削弱后期的變異，或者為花藥培養(yǎng)品種尋求更多穩(wěn)定可行的技術(shù)。

［1］GERMANA M A．Anther culture for haploid and doubled haploid production［J］．Plant Cell Tiss Organ Cult，2011，104:283 －300．

［2］GUHA S，MAHESHWARI S C．in vitro production of embryos from anthers of Datura［J］．Nature，1964，204:497．

［3］賈興華．細(xì)胞工程在煙草品種改良上的應(yīng)用［J］．中國煙草學(xué)報，1991(1):40－45．

［4］付迎軍，任海祥，白艷鳳，等．糖液預(yù)處理對提高玉米花培誘導(dǎo)率的研究［J］．玉米科學(xué)，2004，12(1):111 －113．

［5］陳曉，詹玉絲，齊衛(wèi)強(qiáng)．建立辣椒DH純系中花藥培養(yǎng)的研究［J］．辣椒雜志，2003(3):17 －20．

［6］陳春艷，劉仁祥，雷紅梅，等．低溫預(yù)處理對煙草花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(5):16 －18．

［7］歐陽俊聞，胡含，莊家駿，等．小麥花粉植株的誘導(dǎo)及其后代的觀察［J］．中國科學(xué)，1973(1):72 －82．

［8］劉仁祥，雷紅梅，焦劍，等．煙草花藥培養(yǎng)中活性炭的作用機(jī)理及替代配方研究［J］．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007(4):762－767．