曾 蓉,王明力
(1.貴州大學化學與化工學院,貴州貴陽 550025;2.貴陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心,貴州貴陽 550081)
孔雀石綠(MG)是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體,屬三苯甲烷類染料,作為殺真菌劑和消毒劑被廣泛應用在水產(chǎn)養(yǎng)殖上[1]??兹甘G被魚體吸收后會代謝為危害更大的隱形孔雀石綠(LMG)和隱形結(jié)晶紫(LCV),并沉積于脂肪組織,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠具有高毒、高殘留、致畸、致癌、致突變等副作用,殘留時間達到100 d以上,目前許多國家已禁用孔雀石綠。日本、美國、歐盟已不允許其作為獸藥用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上。我國在2002年在《動物性食品中獸藥殘留最高限量》(農(nóng)業(yè)部公告235號)中將孔雀石綠列為禁用藥[2],在動物性食品中不得檢出。但因其價格低廉,在水霉病防治方面尚未有很好的替代品,所以在水產(chǎn)養(yǎng)殖、運輸過程中仍有違規(guī)使用,在不同程度上存在禁而不止的現(xiàn)象[3]。
隨著科學技術(shù)的發(fā)展,檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫類物質(zhì)的手段和方法多種多樣,檢測儀器越來越靈敏。常見方法有國家標準、ELISA試劑盒和膠體金試紙3類。2006年我國頒布了國家標準GB/T20361-2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》[4],該標準方法的準確度較高,但檢測步驟多,樣品前處理繁瑣、費時、檢測成本高,使用有機溶液量大,儀器設(shè)備昂貴,不適于對大量樣品進行低成本快速篩選、現(xiàn)場判定的需要。如何采用最快捷、最經(jīng)濟、最準確的檢驗方法,是食品安全的一項重要研究內(nèi)容,就目前的發(fā)展趨勢看食品安全檢測方法首先要體現(xiàn)快速,因為食品生產(chǎn)者、經(jīng)營者、監(jiān)督者都需要準確而又及時的監(jiān)控結(jié)果。鑒于此,筆者選用一種酶聯(lián)免疫試劑盒分別對市場抽取43份水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量進行了速測,旨在為水產(chǎn)品安全檢測提供參考。
1.1 材料
1.1.1 儀器。電子天平(瑞士梅特勒公司)、離心機(上海安亭儀器廠)、微孔酶標儀(美國寶特公司)、洗板機(美國寶特公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)、氮氣吹干裝置(瑞士Buchi公司)、離心管、微量移液器(單道 20~200 μl、100~1 000 μl)。
1.1.2 試劑。乙酸乙酯(分析純)、冰乙酸(分析純)、正己烷(分析純)、孔雀石綠隱性高濃度標準品(2.5 μg/L)、孔雀石綠ELISA檢測試劑盒(力德力諾生物技術(shù)有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備與提取。水產(chǎn)品樣品去除非食用部分,用勻漿器均質(zhì)樣品;稱取(1.00±0.05)g勻漿樣品至50 ml離心管中,加入10 ml冰醋酸-乙酸乙酯(1∶99,V/V)溶液,劇烈振蕩2 min;室溫下4 000 r/min離心10 min,取1 ml上層液于離心管中,加入氧化劑液50 μl,輕輕搖勻后室溫避光放置3~5 min;40℃氮氣吹干,吹干后立即加入1 ml樣品稀釋液,再加入1 ml正己烷,渦動20 s混勻,4 000 r/min離心5 min;去除上層有機相,取下層水相50 μl進行檢測。
1.2.2 酶標板操作。取出所需的酶標板孔,在每孔中加入50 μl工作標準品 (0、0.1、0.3、0.9、2.7、27.0 ng/ml)和樣品于所設(shè)定的孔中。在每孔中加入50 μl抗體,輕敲微孔板邊緣1 min混勻。25℃避光環(huán)境中反應30 min。
洗板4~5次,每次應該加入250 μl 1倍洗液,最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干。加入100 μl酶標物,輕敲微孔板邊緣混勻,在25℃下避光培養(yǎng)30 min。重復洗板步驟,加入底物A液50 μl,再加底物B液50 μl,輕輕振蕩混勻,25℃下避光反應15~20 min。加入50 μl終止液終止反應,在450 nm波長下測定每孔OD值。
1.2.3 樣品加標回收率試驗。用已檢測的陰性樣品做基體空白,取(1.00 ±0.05)g勻漿樣品,分別加入 0.1 μg/ml孔雀石綠標準溶液 100、300、500 μl,每個濃度2 個平行,采用該試驗方法測定回收率。
2.1 孔雀石綠的標準曲線 結(jié)果表明,孔雀石綠含量(x,ng/ml)與吸光度之比(y=B/B0,%)的線性方程為:y=-22.889lnx+30.763,R2=0.998 7(圖1)。
表1 不同濃度樣品加標回收率
2.2 樣品中孔雀石綠檢測結(jié)果 共檢測樣品43份,其中檢出陽性結(jié)果樣品有3份,殘留量分別為2.137、1.581、1.439 μg/kg,檢出率為6.98%。均超過水產(chǎn)品中孔雀石綠限量標準1.000 μg/kg。
2.3 樣品加標回收率 由表1可知,水產(chǎn)品中孔雀石綠的平均回收率為78.27% ~88.73%,表明試驗方法回收率穩(wěn)定、可靠。
樣品檢測如為陰性結(jié)果,可直接排除水產(chǎn)品中含有孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留;如為陽性結(jié)果,需進一步用高效液相色譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證和定量。該試驗中檢出的3份陽性樣品用高效液相色譜法確認后,均檢出含有孔雀石綠殘留。
ELISA試劑盒的所有試劑需要恢復至20~25℃保證靈敏度,吸附試驗中溶液每次加量要嚴格相同,酶標板洗板時確保干凈,甩干并在吸水紙上吸干后使用。
酶聯(lián)免疫快速檢測技術(shù)相對傳統(tǒng)和經(jīng)典的化學檢測和儀器檢測而言,其特點是檢測所需的時間相對較少,對儀器設(shè)備、操作人員等條件要求不高,樣品前處理簡單,既快速方便又節(jié)約成本,可滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留的篩選以及疑似樣品的確證,應用前景廣闊,有利于政府監(jiān)管并指導企業(yè)自控,促進水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量的提高,保護消費者身體健康,提高我國水產(chǎn)品的國際競爭力。
[1]史東杰,孫向軍,梁擁軍,等.水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留檢測的ELISA與HPLC 法的比較[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息,2009,24(4):11-14.
[2]農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號:動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].2002.
[3]王麗玲.應用快速檢測試劑盒預測水樣和水產(chǎn)品中孔雀石綠[J].實用預防醫(yī)學,2007,14(6):1900 -1901.
[4]鄭斌,趙紅萍,冷凱良,等.GB/T20361-2006,水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定[S].北京:中國標準出版社,2006.