梁美蓮，顧玉珠，任一丹，于洋(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

我國具有豐富的豬血資源，每年豬血總量約為108kg，豬血由血細(xì)胞和血漿組成，血漿蛋白約占血液總量的4.6%，血漿蛋白中含量最高的是白蛋白，其次為免疫球蛋白，約為血漿蛋白的16.3%，占全血的0.75%。根據(jù)自由界面電泳結(jié)果可知，IgG 屬于 γ 球蛋白［1］。

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是一類具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白，其分子呈Y型結(jié)構(gòu)，由長鏈H鏈和短鏈L鏈構(gòu)成，相對分子質(zhì)量15 000～90 000，依抗原性不同可分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等。Ig具有類似蛋白質(zhì)的通性，加熱至60～70℃即被破壞。它能被中性鹽類沉淀，在紫外區(qū)有光吸收，吸光度與其濃度成正比。Ig在pH＜2.6或pH＞7.6時(shí)不穩(wěn)定，若pH＜2.6或pH＞7.6時(shí)加熱 Ig變性嚴(yán)重［2］。

G型免疫球蛋白(IgG)的相對分子量為160 000，其含量占血清的1.5% ～1.8%，約占血清蛋白總量的17%，血清中免疫球蛋白總量的75%～80%。IgG是動物血清中最重要的抗體，在體液免疫中起著“主力免疫”的作用［1］。血清中Ig的分離方法有飽和硫酸銨分步鹽析法(AS)、辛酸沉淀法、氯化鐵沉淀法、多聚磷酸鹽鹽析法、乙醇分離法、柱色譜分離法及超濾法。免疫球蛋白已被廣泛應(yīng)用于保健食品、仔畜飼料以及生物新藥和醫(yī)藥生化診斷、檢測試劑等，已經(jīng)成為科學(xué)研究和商業(yè)等部門重要的物質(zhì)，隨著人們保健意識的增強(qiáng)，免疫球蛋白功能食品必將進(jìn)一步開拓市場，產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。筆者以豬血為原料，采用飽和硫酸銨法提取新鮮豬血中IgG，采用紫外分光光度法測定提取豬血中IgG含量，研究用紫外分光光度法測定豬血中IgG含量的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料。新鮮抗凝豬血:來源于錦州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，4 000 r/min離心10 min后得到血漿，－80℃下保存?zhèn)溆?。豬IgG對照品，購自北京博爾西科技有限公司;硫酸銨、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備。PHS－3B精密pH計(jì)，為上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;DK－98－11A型恒溫水浴鍋，為天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品;TDH－5－A離心機(jī)，為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;SP－752分光光度計(jì)為上海光譜儀器公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

1.2.1.1 飽和硫酸銨溶液的配制。稱取 150、200、250、300、350、400和450 g硫酸銨，分別加入1 000 ml的蒸餾水，不斷攪拌加熱至40℃，靜置40 min，趁熱過濾，濾液在室溫中過夜，有結(jié)晶析出即達(dá)到飽和，用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.4。

1.2.1.2 雙縮脲試劑。稱取1.50 g硫酸銅(CuSO4·5H2O)和6.0 g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)，用 500 ml水溶解，在攪拌下加入300 ml 10%NaOH溶液，溶解后用水定容至1 000 ml，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 飽和硫酸銨法提取過程。新鮮抗凝豬血，分離出血漿;加入飽和硫酸銨，恒溫水浴靜置，離心分離，除去纖維蛋白;再加飽和硫酸銨，恒溫水浴靜置，離心分離，所得沉淀即為IgG粗品;粗品經(jīng)超濾除鹽，冷凍干燥，即為IgG純品。

1.2.3 紫外分光光度法檢測IgG含量。取6個(gè)比色皿，分別加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6 和 2.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 1 ml(各濃度做3個(gè)平行管)，用超純水補(bǔ)至2 ml，然后加入4 ml雙縮脲試劑。充分搖勻后，在40℃下放置40 min，于波長543 nm處進(jìn)行比色測定。

2 結(jié)果與分析

飽和硫酸銨沉淀法提取血漿中的免疫球蛋白，是在蛋白質(zhì)的緩沖液中加入中性的硫酸銨溶液來達(dá)到鹽析沉淀蛋白質(zhì)的目的，因此蛋白質(zhì)在緩沖液中的溶解度、溫度、靜置時(shí)間、pH直接影響到IgG的提取效果。依據(jù)文獻(xiàn)采用不同硫酸銨百分比飽和溶液、溫度40℃、靜置時(shí)間40 min、pH7.4作為豬血IgG提取參數(shù)［3］。

2.1 豬血去除纖維蛋白原 由表1可知，最適宜的硫酸銨濃度為20%，此時(shí)纖維蛋白原量最高，達(dá)0.189 3 g。

表1 不同硫酸銨濃度下從豬血中提取的纖維蛋白原

2.2 豬血IgG的提取 由表2可知，從豬血中提取IgG最適宜的硫酸銨濃度為35%，此時(shí)IgG含量為0.125 2 g。

表2 不同百分比硫酸銨飽和溶液豬血中提取的IgG含量

2.3 紫外分光光度法檢測IgG含量

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。紫外分光光度法測得的IgG對照品的A值與其濃度(y)的關(guān)系如圖1所示。線性回歸方程為:y=0.960 9x－0.041 8(R2=0.998 6)，表明 lgG 濃度與 A值具有顯著的線性相關(guān)性。

2.3.2 待測樣品lgG含量的測定。取出7個(gè)比色皿，用上述同樣的方法測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度，對應(yīng)于測得的待測IgG的7組A值，計(jì)算其濃度(表3)。

表3 樣品中IgG的含量

3 討論與結(jié)論

3.1 硫酸銨飽和度與豬血清蛋白沉淀組成的關(guān)系 飽和硫酸銨沉淀法提取血漿中的免疫球蛋白，是在蛋白質(zhì)的緩沖液中加入中性的硫酸銨溶液來達(dá)到鹽析沉淀蛋白質(zhì)的目的，因此蛋白質(zhì)在緩沖液中的溶解度直接影響到IgG的提取效果［4］。硫酸銨能夠削弱血清中蛋白質(zhì)的水合程度，降低其溶解度，從而使蛋白質(zhì)沉淀出來［5］。由于等電點(diǎn)能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的析出，因此筆者將樣品 pH調(diào)節(jié)至7.4，靜置40 min，溫度40℃，獲得IgG最多的硫酸銨濃度為30% ～35%。

3.2 紫外分光光度法檢測提取豬血中IgG活性 動物血清IgG制品種類相當(dāng)豐富，而與之相對應(yīng)的測定其含量和活性的方法主要是基于免疫擴(kuò)散法，包括免疫單擴(kuò)散和免疫雙擴(kuò)散，但因?yàn)槊庖邤U(kuò)散法均是基于沉淀環(huán)，導(dǎo)致測量精度不是很好［6］。目前，我國藥典采用的測定方法除了免疫單擴(kuò)散和免疫雙擴(kuò)散法［7］外，較簡便的方法就是紫外可見分光光度法［8］，此法系依據(jù)血液中的IgG與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合后，在適宜的電解質(zhì)、溫度、pH條件下產(chǎn)生凝集反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，根據(jù)供試品的吸光度計(jì)算出其中IgG的含量。紫外分光光度法測定的結(jié)果包含了部分殘存的雜蛋白和有活性及無活性的IgG。同免疫單擴(kuò)散方法測定動物血清IgG制品含量相比，紫外分光光度方法數(shù)據(jù)穩(wěn)定，線性關(guān)系好，準(zhǔn)確性高，費(fèi)時(shí)短，方法簡便易行，適合推廣。

硫酸銨法分離豬血中免疫球蛋白，溫度40℃，靜置40 min，pH7.4時(shí)，去除纖維蛋白原的最適飽和硫酸銨溶液濃度為20%;獲得粗IgG最多的硫酸銨濃度為35%;IgG含量最高時(shí)硫酸銨濃度為35%。

［1］臧盛，張立娟，吳明文，等.豬血免疫球蛋白的研究進(jìn)展［J］.肉類工業(yè)，2011(1):52－54.

［2］郭本恒，駱承癢.牛初乳免疫球蛋白變性動力學(xué)研究［J］.食品科學(xué)，1996，17(7):10 －13.

［3］胡曉艷，王春維，趙勝軍，等.飽和硫酸銨法提取IgG工藝的優(yōu)化［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2009，24(1):119 －120.

［4］崔妍妍.免疫球蛋白的檢測及分離技術(shù)分析［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2014(14):3100 －3101.

［5］張宜濤，于偉，江國永，成國祥.兩種方法純化豬血清免疫球蛋白IgG的比較［J］.飼料與畜牧，2012(2):41－43.

［6］張效榮，于福滿，程瑜茗.豬血免疫球蛋白提取條件的優(yōu)化研究［J］.肉類工業(yè)，2014(9):23－26.

［7］陳雅蕙，陳來同，胡曉倩，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法［M］.北京:北京大學(xué)出版社，2005.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄XIK.