李 堅，蘇媚，孔周陽，閆俊芳，張萍萍，祁偉，談建中

(蘇州大學建筑與城市環(huán)境學院，蘇州市建筑與城市環(huán)境重點實驗室，江蘇蘇州215123)

花色是觀賞植物最重要的經(jīng)濟性狀之一，花色的形成涉及體內(nèi)復雜的生理代謝過程，受基因型及環(huán)境因素影響而呈現(xiàn)豐富多彩的花色表型［1］。近年來，有關觀賞植物花色變異機理的研究主要集中在核酸分子水平上，如采用定量PCR技術探討不同花色品種花色素代謝相關基因的差異表達情況［2－3］，而利用花色嵌合體進行差異蛋白質(zhì)組研究相對較少。由于蛋白質(zhì)組學技術在研究特定功能蛋白方面具有很強的針對性，能快速、直觀、全面反映植物組織或細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)種類、表達水平、修飾狀態(tài)以及蛋白質(zhì)之間的相互作用，有利于從整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成和調(diào)控規(guī)律［4］，迄今在擬南芥［5］、水稻［6］、玉米［7］等植物中已有較多研究。該研究供試的菊花花色嵌合體表現(xiàn)為紫紅－黃色鑲嵌，扦插繁殖時仍表現(xiàn)為嵌合性狀。為探討其花色變異的形成機理，筆者采用蛋白質(zhì)凝膠電泳和生物質(zhì)譜技術，分析與鑒定了嵌合花色相關的差異表達蛋白質(zhì)，以便為闡明菊花花色變異的分子機理提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料 菊花花色嵌合體材料‘su-07’取自蘇州大學苗圃基地，在盛花期分別采取黃色和紫色花瓣，用蒸餾水洗凈后，濾紙吸干水分備用。

1.2 葉片和花瓣蛋白質(zhì)的提取 分別取黃色和紫色花瓣各1 g，液氮研磨后，參照文獻［8］的方法提取蛋白質(zhì)樣品，重懸于適量樣品緩沖液(8 mol/L尿素、2%CHAPS、15 mmol/L DTT、0.5%IPG Buffer)備用。

1.3 蛋白質(zhì)的雙向電泳 雙向電泳的第1向為固相pH梯度等電聚焦電泳，采用IPGphor等電聚焦儀(GE公司)進行，IPG膠條長17 cm，pH3～10(NL)，蛋白質(zhì)樣品上樣量為1 mg。水化時，用水化液(8 mol/L Urea，2%CHAPS，15 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer)補足至350 μl，根據(jù) IPG 等電聚焦儀使用指南進行操作。等電聚焦結束后，IPG膠條平衡2次，每次 15 min。平衡緩沖液Ⅰ為 0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.8)，6 mol/L Urea，30% 甘油，2%SDS，1%DTT;平衡緩沖液Ⅱ用1.25%碘乙酰胺代替DTT。第2向SDS-PAGE的聚丙烯凝膠濃度為12%分離膠，電泳結束后，采用考馬斯亮藍R250進行染色。

1.4 蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定 采用2-DE圖像分析軟件Image Master 2D Platinum 5.0對凝膠圖譜進行分析，從中選取差異蛋白質(zhì)斑點，委托上海中科新生命生物科技有限公司進行質(zhì)譜分析和鑒定。

2 結果與分析

2.1 菊花嵌合體花瓣蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析 供試的菊花花色嵌合體在不同枝條上發(fā)育形成2種不同顏色的花瓣，表現(xiàn)為“雙色花”與“雙色花瓣”類型，花色差異顯著。從花瓣蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜看(圖1)，紫色花瓣與黃色蛋白質(zhì)的種類和含量差異較大，如在黃色花瓣中(圖1P1)，分子量73 kD、22 kD左右的蛋白質(zhì)組分表達量較高，并多了一種分子量66 kD左右的蛋白組分，而在14～31 kD的低分子量區(qū)域內(nèi)蛋白質(zhì)組分的表達量較低。與此不同的是，不同花色花瓣著生部位的葉片蛋白質(zhì)種類和含量幾乎完全相同(圖1L1、L2)，說明兩者在基因表達方面并無差異。

2.2 菊花嵌合體花瓣蛋白質(zhì)的雙向電泳分析 由于不同花色花瓣蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜存在差異，該研究進一步應用雙向電泳技術對黃色與紫色花瓣的蛋白質(zhì)組分進行了分離與鑒定，其雙向電泳結果見圖2。由圖2可知，花瓣蛋白質(zhì)的2-DE分離效果良好，蛋白質(zhì)斑點主要分布在等電點pI 5.0～9.0、分子量31～97 kD。在黃色和紫色花瓣2-DE圖像中，分別檢測到了500和523個蛋白斑點，其中匹配斑點474個，匹配率92.67%，其中表達量差異達到2倍及以上的蛋白斑點有139個。

2.3 花色相關差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析與鑒定 從表達差異2倍以上的斑點中，選擇16個表達量較豐富且分離效果良好的蛋白質(zhì)斑點進行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，結果成功鑒定了其中的10個組分，可將其分為3種類型:①糖代謝相關蛋白，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸變位酶、轉酮醇酶等;②花色素代謝相關蛋白，如黃烷酮-3-羥化酶、查爾酮異構酶;③基因調(diào)控相關蛋白，如富含甘氨酸RNA結合蛋白、真核翻譯起始因子、polyA結合蛋白等(表1)。

3 討論

表1 菊花花色差異相關蛋白質(zhì)組分的鑒定結果

植物性狀是基因控制和環(huán)境影響的結果，而蛋白質(zhì)既是基因表達的最終產(chǎn)物，也參與基因的表達和調(diào)控。在該研究中，供試材料的雙色花瓣具有相同的基因組結構，但2-DE圖譜顯示的蛋白質(zhì)表達譜及表達量存在一定差異，鑒定的10個差異蛋白質(zhì)分別涉及到糖代謝、花色素代謝及基因調(diào)控等生命過程。

在鑒定的差異蛋白質(zhì)中，F(xiàn)3H、CHI和SAMS與花色素合成直接相關，其中F3H是花色素苷合成過程中的關鍵酶，影響原花青素、花色素苷等的形成［9］。在該研究中，F(xiàn)3H在紫色花瓣中顯示了特異表達的特征，表明嵌合花瓣在花色素苷合成代謝方面存在差異。其次，CHI是黃酮代謝途徑中一個關鍵酶，降低或抑制CHI活性會使花色苷合成途徑上游產(chǎn)物的積累和下游反應底物的缺乏［10］。在供試嵌合體的黃色花瓣中，CHI的表達量高于紫色花瓣，這與黃色花瓣的顯色特點有關。另外，還檢測到SAMS在紫色花瓣中的表達量明顯高于黃色花瓣，而SAMS是植物體內(nèi)的甲基供體，參與植物的轉甲基反應［11－12］，且有研究表明隨著花色素甲基化和糖基化程度的增加，其共色效應也相應增加，從而加強花色素苷的呈色［13］，說明紫色表型與花色素苷的甲基化修飾有關。

此外，在鑒定的其他蛋白質(zhì)中(表1)，磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及轉酮醇酶在糖代謝過程中起著重要作用［14］，但尚未見與菊花花瓣顯色差異相關的報道，推測與花色素的糖基化有關;此外，鑒定的蛋白質(zhì)如富含甘氨酸RNA結合蛋白、Poly(A)結合蛋白、真核細胞翻譯起始因子涉及基因的表達調(diào)控，但對菊花嵌合體花色素合成相關基因表達的作用機理目前尚不清楚，有待今后進一步研究。

［1］王小菁，孟祥春，彭建宗.花色形成與花生長的調(diào)控［J］.西北植物學報，2003，23(7):1105 －1110.

［2］葛靜，嚴海燕.花色素苷形成中的基因表達和調(diào)控［J］.植物生理學通訊，2006，42(2):374－379.

［3］張玉進，孟祥春，潘瑞熾，等.非洲菊苯基苯乙烯酮合成酶CHS基因表達模式的初步研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2002，23(2):89－90.

［4］高華，高述民，孫芳芳.蛋白質(zhì)組學及其在植物研究中的應用［J］.安徽農(nóng)學通報，2010，16(8):31 －32.

［5］LINDERMAYR C，SAALBACH G，DUNIER J.Proteomic identification of nitrosylated proteins in Ara Mdopsis［J］.Plant Physiology，2005，137(3):921－930.

［6］柴小清，靳飛，張艷萍，等.缺鐵逆境脅迫下水稻葉蛋白質(zhì)組的雙向電泳分析［J］.首都師范大學學報，2004，25(3):46－51.

［7］CHANG W W，HUANG L，SHEN M.Patterns of protein synthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedings acclimated to a low-oxygen environment，and identification of proteins by mass spectrometry［J］.Plan Physiol，2000，122(2):295 －318.

［8］WANG W，VIGNANI R，SCALI M，et al.A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis［J］.Electroph-oresis，2006，27:2782 －2786.

［9］MARTENS S，MITHOFER A.Flavones and Flavone Synthases［J］.Phytochemistry，2005，66:2399 －2407.

［10］李琳玲，程華，許鋒，等.植物查爾酮異構酶研究進展［J］.生物技術通訊，2008，19(6):935－937.

［11］TABOR C W，TABOR H.Methionine adenosyltransferase(S-adenosylmethionine synthetase)and S-adenosylmethionine decarboxylase［J］.Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology，1984，56:251－282.

［12］DUTHIE S J，NARAYANAN S，BRAND G M，et al.DNA stability and genomic methylation status in colonocytes isolated from methyldonor-deficient rats［J］.European Journal of Nutrition，2000，39:106 －111.

［13］MAZZA G，BROUILLARD R.The mechanism of copigmentation of anthocyanins in aqueous solutions［J］.Phytochemistry，1990，29:1097 －1102.

［14］MARTIN W，BRINKMANN H，SAVONNA C，et al.Evidence for a chimeric nature of nuclear genomes:eubacterial origin of eukaryotic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(13):86－92.